細(xì)胞外囊泡調(diào)控哺乳動物胚胎附植研究進(jìn)展

張 蓉，趙 樂，楊海麗，楊永恒，程文強，趙永聚

(西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 草食動物科學(xué)重慶市重點實驗室 重慶市草食動物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

胚胎附植是指哺乳動物受精卵發(fā)育成囊胚定位于子宮，結(jié)束游離狀態(tài)，與母體子宮建立初步聯(lián)系的過程，又稱胚胎著床。它是妊娠建立的關(guān)鍵步驟，也是早期胚胎生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。胚胎附植包括定位、黏附和并置等過程，一旦附植成功，胚胎和子宮內(nèi)膜會隨著生理狀態(tài)的變化而發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的改變，例如：子宮內(nèi)膜發(fā)生增殖、分化，滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲，胎盤逐漸發(fā)育形成，從而保證母胎之間信息的交流和物質(zhì)的交換。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物早期胚胎丟失占妊娠失敗的1/3，其中約有75%的胚胎在著床前后發(fā)生丟失[1-2]。因此，研究胚胎附植的調(diào)控機制對保證哺乳動物成功妊娠和提高哺乳動物繁殖率具有重要意義。

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由真核細(xì)胞和原核細(xì)胞分泌的膜性囊泡的異質(zhì)群體[3]，包括外泌體、微囊泡、凋亡小體等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡作為細(xì)胞間通訊，廣泛參與機體生理和病理狀態(tài)過程，其在配子發(fā)生、受精、胚胎附植、胚胎發(fā)育及胎盤形成等生殖過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，哺乳動物子宮內(nèi)膜、胚胎、子宮液及胚胎培養(yǎng)基中均存在細(xì)胞外囊泡，且自身和攜帶的內(nèi)容物能夠影響胚胎的生存力和子宮環(huán)境[5]。本文主要闡述了細(xì)胞外囊泡在哺乳動物胚胎附植中的調(diào)控作用，以期為研究細(xì)胞外囊泡在哺乳動物胚胎附植中的調(diào)控作用提供理論參考。

1 細(xì)胞外囊泡及其生物學(xué)功能

1.1 細(xì)胞外囊泡的形成及組分

細(xì)胞外囊泡是一種由內(nèi)體或質(zhì)膜脫落而成的膜結(jié)合的納米囊泡，其內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、DNA、mRNA/miRNA、脂質(zhì)等，在機體體液，包括血液、尿液、乳汁、子宮液、羊水等[6-9]中廣泛分布，其也可以由細(xì)胞分泌產(chǎn)生，如滋養(yǎng)層細(xì)胞、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、胚胎等[10-13]。由于不同細(xì)胞來源分泌的細(xì)胞外囊泡形態(tài)和組成存在差異，因此，目前對細(xì)胞外囊泡并沒有確切的命名。根據(jù)細(xì)胞來源、大小、形態(tài)和內(nèi)容物含量將細(xì)胞外囊泡主要分為兩大類：外泌體(exosomes)和微囊泡(microvesicles，MVs)(表1)。

表1 細(xì)胞外囊泡的類型及特征Table 1 Types and characteristics of extracellular vesicles

外泌體作為細(xì)胞外囊泡的亞型，它以腔內(nèi)囊泡(ILV)的形式在內(nèi)體系統(tǒng)內(nèi)生成，并在多囊泡體(multivesicular body,MVB)與細(xì)胞表面融合的過程中被分泌[14]，蛋白則是細(xì)胞外囊泡形成的第一調(diào)節(jié)器。外泌體膜蛋白從高爾基體到達(dá)內(nèi)體或從質(zhì)膜內(nèi)化，然后在內(nèi)體成熟過程中被分類為ILVs，而這一過程涉及特定的分選機制。這些分選機制中內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT)機制作為膜成形和剝離的驅(qū)動器，揭示MVB和ILV形成機制[15]。它以逐步方式運行，其中ESCRT-0和ESCRT-Ⅰ亞基聚集泛素化跨膜蛋白位于MVB限性膜的微區(qū)，并通過ESCRT-Ⅱ吸收能夠萌發(fā)和分裂該微區(qū)的ESCRT- Ⅲ亞復(fù)合物。也有研究表明，可以不依賴于ESCRT機制仍形成以載有CD63的ILV為特征的MVB[16]，這需要神經(jīng)酰胺、四跨膜蛋白等的參與[17-21]。

微囊泡，起初被發(fā)現(xiàn)是來自于正常血漿和血清中血小板的亞細(xì)胞物質(zhì)，稱作“血小板灰塵”[22]。后來發(fā)現(xiàn)，受刺激的中性粒細(xì)胞經(jīng)胞吐作用釋放出質(zhì)膜囊泡[23]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，它們在不同細(xì)胞類型中的細(xì)胞間通訊發(fā)揮作用，包括癌細(xì)胞[24]，通常稱為“脂質(zhì)體”。它由質(zhì)膜向外出芽和裂變，隨后釋放到細(xì)胞外空間，其具體生物發(fā)生機制尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，它的形成需要質(zhì)膜內(nèi)的幾種分子重排，包括脂質(zhì)成分和蛋白質(zhì)組成的變化以及Ca2+水平的改變，還需細(xì)胞骨架成分及其調(diào)節(jié)劑[25-27]。它的釋放需要從質(zhì)膜裂變，這一機制依賴于肌動蛋白和肌球蛋白與ATP依賴性收縮的相互作用[21,28]。

1.2 細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)功能

細(xì)胞外囊泡參與機體的多種生理/病理過程：1)參與細(xì)胞間通訊：細(xì)胞外囊泡攜帶遺傳物質(zhì)運送到受體細(xì)胞影響細(xì)胞功能，能夠作為細(xì)胞間信息交流和物質(zhì)交換的載體；2)參與免疫應(yīng)答：細(xì)胞外囊泡被證實能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[29]；細(xì)胞外囊泡含有免疫抑制HLA-G，可調(diào)節(jié)母體免疫耐受來促進(jìn)胚胎發(fā)育[30]；3)作 為生理/病理標(biāo)志物：細(xì)胞外囊泡包裹的RNA在本質(zhì)上是其來源細(xì)胞的內(nèi)容物和狀態(tài)的寫照，且能夠免于miRNA降解，因此能夠作為生理/病理標(biāo)志物；4)作為藥物載體：細(xì)胞外囊泡可保證治療劑的用量和生物活性，且具有較低免疫抗原性和毒性等特點，可以作為藥物運載工具[31]。

2 細(xì)胞外囊泡調(diào)控哺乳動物胚胎附植

胚胎附植是一個復(fù)雜且動態(tài)化的生理過程，涉及到母體子宮與胚泡之間的密切交流和溝通。只有胚泡和子宮經(jīng)歷同步發(fā)育和雙向串?dāng)_，建立結(jié)構(gòu)聯(lián)系從而保證胚胎成功植入。胚泡由兩種不同類型的細(xì)胞組成：形成胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)和圍繞ICM并最終形成胎盤的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞[32-33]，后者負(fù)責(zé)將胚泡附植于子宮內(nèi)膜上皮，并進(jìn)行遷移和侵襲進(jìn)而植入胚胎。這一過程受到可溶性生長因子、激素、黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 等多種因素的調(diào)節(jié)，這些因素可以通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌方式參與胚胎附植的調(diào)控[34]。早期細(xì)胞外囊泡被當(dāng)作是細(xì)胞向外界排泄“廢物”的一種途徑，而近年來發(fā)現(xiàn)，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞間信息交流和物質(zhì)交換。由胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡能將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到滋養(yǎng)層細(xì)胞并被其吸收，從而促進(jìn)胚胎的植入[13]。這進(jìn)一步說明，細(xì)胞外囊泡可將miRNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)運輸至相應(yīng)的受體細(xì)胞，從而影響受體細(xì)胞的生理功能。

2.1 細(xì)胞外囊泡miRNA與胚胎附植

miRNA是長度為19～22 nt的小型非編碼RNA，它最主要靶向mRNA從而引起mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄抑制，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[35-36]。它能參與多種生物學(xué)過程，例如配子發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、著床及胎盤形成[37-38]。有研究表明，miRNA作為細(xì)胞外囊泡的主要組成成分，不同細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡miRNA不僅可以調(diào)控囊胚的分化、生長、發(fā)育及炎癥反應(yīng)，還可以調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[39](表2)。

表2 參與哺乳動物胚胎附植的細(xì)胞外囊泡miRNAsTable 2 miRNAs in extracellular vesicles involved in mammalian embryo implantation

胚胎附植是胚胎與子宮內(nèi)膜相互接觸，建立直接聯(lián)系的生物學(xué)過程。這一過程會涉及多種分子的參與，從而形成特殊的子宮腔微環(huán)境，促使子宮內(nèi)膜達(dá)到最佳容受狀態(tài)，來接受活化的囊胚。研究者們檢測了人[40]、豬[41]和綿羊[42]的子宮液發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡中包裹著miRNA。Krawczynski等[41]發(fā)現(xiàn)，豬子宮腔液中細(xì)胞外囊泡攜帶的miR-125b可能通過抑制LIF、LIFR和IL-6R基因的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)子宮容受性、免疫、胚胎/滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育和著床。然后對植入不同階段小鼠子宮內(nèi)膜釋放的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行miRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p、miR-210、miR-369-5p、miR-30b和miR-582-5p在植入窗口期(WOI)富集，還發(fā)現(xiàn) miR-34c-5p可以通過靶向子宮內(nèi)膜的生長停滯特異性1(GAS1)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，參與胚胎植入過程[43]。Burns等[42]對空懷14 d母羊和妊娠14 d母羊子宮液細(xì)胞外囊泡進(jìn)行高通量測序分析，結(jié)果共檢測到53種miRNAs，而僅miR-423在妊娠母羊子宮腔液中被檢測到，生物信息學(xué)分析顯示，它廣泛參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生理過程。母體免疫系統(tǒng)也會參與調(diào)節(jié)母胎免疫的微環(huán)境，保證妊娠正常進(jìn)行，而細(xì)胞外囊泡攜帶的miRNA會參與其中并發(fā)揮重要作用。研究者將利用附植分離得到的子宮液細(xì)胞外囊泡處理牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，其攜帶miR-98參與母體免疫功能的調(diào)節(jié)，促使胚胎成功附植于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞[44]。

胚胎成功附植，除了需要具有良好容受性的子宮內(nèi)膜，還需要活化的優(yōu)質(zhì)胚胎。在胚胎發(fā)育過程中，胚胎的生存環(huán)境會影響胚胎的發(fā)育，其狀態(tài)會影響細(xì)胞外囊泡miRNA的釋放。Kropp等[45]檢測了發(fā)育成熟的和退化的牛胚胎培養(yǎng)基中的5種miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在退化胚胎中miR-181a、miR-196a2、miR-302c和miR-25的表達(dá)水平相對較高。Rosenbluth等[46]發(fā)現(xiàn)，胚胎培養(yǎng)液中的miRNA 會根據(jù)受精率、染色體狀況和妊娠結(jié)局出現(xiàn)差異表達(dá)，如miRNA-191在非整倍體胚胎的培養(yǎng)基中濃度較高，miR-191、miR-372和miR-645在IVF/ICSI中高表達(dá)。研究者將妊娠階段的小鼠子宮液外泌體與胚泡進(jìn)行共培養(yǎng)后，提高了囊胚形成率，并且在植入后，miR-21的表達(dá)隨著外泌體濃度而上調(diào)[47-48]。將來源于卵巢液、羊膜的細(xì)胞外囊泡添加到胚胎培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，其能夠提高胚胎孵化率和植入率，誘導(dǎo)DNA甲基化調(diào)控表觀遺傳，參與早期胚胎發(fā)育過程，還能夠上調(diào)相關(guān)miRNAs的表達(dá)，如miR-130a、miR-181b和miR-631[49-50]。這些都表明，特異性miRNA的分泌可能與胚胎發(fā)育有關(guān)，因此，可以通過檢測特異性miRNA來選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎，以保證成功妊娠。

在哺乳動物胚胎附植過程中，還涉及到了母胎之間的相互干擾。體外試驗對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ECC及其分泌的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行miRNA測序分析，其結(jié)果顯示，差異表達(dá)的227個miRNAs中僅 13種miRNAs存在于細(xì)胞外囊泡中，如miR-451、miR-122、miR-124等，并對其靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，顯示這些細(xì)胞外囊泡miRNA與附植相關(guān)的信號通路相互作用，如黏附連接、VEGF信號通路、Jak-STAT通路和toll樣受體信號通路[51]。Vilella等[52]證明，人子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放的外泌體包裹的has-miR-30 d能夠被滋養(yǎng)層細(xì)胞攝取并整合到RISC復(fù)合體中，參與胚胎附植前轉(zhuǎn)錄組修飾和胚胎黏附表型，而miR-30 d敲除小鼠顯示，母體和/或胚胎miR-30 d缺乏會在體內(nèi)損害子宮內(nèi)膜的接受能力和胚胎植入率[53]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，異質(zhì)核糖核蛋白C1(hnRNPC1)可以影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放外泌體中的miR-30 d的含量，影響胚胎植入[54]。對11種豬輸卵管上皮細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡候選miRNAs進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)僅6種miRNAs(miR-19b，miR-19a，miR-203，let-7a，miR-126和miR-103) 表達(dá)，這些miRNAs能夠協(xié)助胚胎經(jīng)過輸卵管進(jìn)入子宮內(nèi)膜進(jìn)行附植[55]。研究者還發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的豬滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可以攜帶miRNAs(miR-16、miR-17-5p、miR-20a)并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，參與胎盤血管生成[56]。綜上，細(xì)胞外囊泡在妊娠早期母胎之間的相互串?dāng)_中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。

2.2 細(xì)胞外囊泡中其他生物活性物質(zhì)與胚胎附植

細(xì)胞外囊泡中除了攜帶多種miRNAs參與哺乳動物胚胎附植過程，同時還有蛋白質(zhì)參與其中(表3)。干擾素τ(IFNτ)是反芻動物胚胎及其滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，它通過旁分泌的方式減少雌激素和催產(chǎn)素受體在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，從而維持黃體活化和孕激素的產(chǎn)生[57]。研究者發(fā)現(xiàn)，子宮腔液外泌體攜帶的母體釋放的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous jaagsiekte retroviruses，enJSRV)通過誘導(dǎo)TLR信號通路刺激滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖并釋放IFNτ，參與胚胎附植和免疫應(yīng)答[58]。

表3 參與哺乳動物胚胎附植的細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)Table 3 Proteins in extracellular vesicles involved in mammalian embryo implantation

不同生理階段的細(xì)胞外囊泡所攜帶的蛋白質(zhì)存在差異，且這些蛋白質(zhì)可以影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能。研究者對不同生理階段綿羊子宮腔液中的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出195種蛋白質(zhì)，其中40種和76種分別特異性表達(dá)于非妊娠和妊娠母羊子宮液細(xì)胞外囊泡，究其來源，發(fā)現(xiàn)其中部分蛋白是由子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞/滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌[42]。Nakamura等[59]對妊娠第15、17天和空懷第15、17天的牛子宮液外泌體進(jìn)行蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CAPG、AKR1BI和IFNτ僅在妊娠階段表達(dá)，推測它們可能是由胚胎分泌到子宮腔液后經(jīng)外泌體運送到子宮組織參與胚胎附植的調(diào)控因子。此外，有研究者將妊娠第17、20和22天的牛子宮腔液外泌體與滋養(yǎng)層TC-1細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),凋亡及黏附相關(guān)基因表達(dá)水平顯著升高[60]。

Greening等[61]發(fā)現(xiàn)，特定激素治療后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(ECC1)衍生的外泌體能增強滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附能力，相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，這些蛋白參與胚胎黏附、遷移、侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等植入的基本過程[61-62]。Desrochers等[13]以小鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)來源胚胎干細(xì)胞的微囊泡誘導(dǎo)FAK和JNK磷酸化，刺激滋養(yǎng)細(xì)胞遷移，促進(jìn)胚胎植入。人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡能夠介導(dǎo)SMAD2和SMAD2上調(diào) N-鈣調(diào)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)層侵入[63]。綜上，子宮內(nèi)膜細(xì)胞或胚胎可以選擇性地將蛋白包裝到細(xì)胞外囊泡，然后運輸?shù)较鄳?yīng)的靶細(xì)胞引發(fā)靶細(xì)胞形態(tài)和功能上的改變，從而促進(jìn)胚胎附植。研究還發(fā)現(xiàn)，外泌體中存在大量的金屬蛋白酶(如MMP-14、ADAM10等)[64]，而這些蛋白被報道廣泛參與ECM的重塑和細(xì)胞表面結(jié)合因子、受體及細(xì)胞因子的釋放[65-67]，能夠影響胚泡的形成率和著床率，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜的容受性，促進(jìn)胚胎附植[11]。

除了miRNA和蛋白質(zhì)以外，外界刺激(光照、氧濃度)也會影響細(xì)胞外囊泡的釋放，調(diào)控胚胎附植。Bognar等[68]將不同光處理后的胚胎移植到假孕雌鼠子宮，第8.5天處死并檢測含核酸的細(xì)胞外囊泡數(shù)量和細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡數(shù)量和細(xì)胞凋亡數(shù)增加，對胚胎發(fā)育潛能無影響而植入能力下降。有研究者用不同氧氣處理體外牛子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)，低氧條件下外泌體含量增加，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，VNN1僅存在于富氧環(huán)境，它可以調(diào)節(jié)子宮的容受性，而ADAM10只在低氧條件下表達(dá)，參與細(xì)胞遷移和黏附[69]。

3 展 望

繁殖性能是影響畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，胚胎附植作為哺乳動物妊娠過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探究胚胎附植的調(diào)控機制對提高畜牧產(chǎn)業(yè)效益顯得尤為重要。細(xì)胞外囊泡作為一種細(xì)胞間交流媒介，在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊、參與免疫反應(yīng)、當(dāng)作藥物載體以及疾病標(biāo)志物等方面越來越受科研工作者的青睞，最近研究表明，其在胚胎與母體的信息交流中發(fā)揮重要作用。目前，細(xì)胞外囊泡對胚胎附植的調(diào)控主要集中于其所包裹的miRNA和蛋白質(zhì)靶向受體細(xì)胞，影響其生理功能和表型變化，但對在這一過程中離子通道的調(diào)控研究較少，進(jìn)一步研究其在胚胎附植過程中的作用，有望揭開復(fù)雜的胚胎附植過程。