細(xì)胞外囊泡及其在創(chuàng)傷性顱腦損傷診療中應(yīng)用的研究進(jìn)展▲

周 娟 秦 喆 李 想 劉 洋

(1 中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)科，天津市 300162，電子郵箱：921592005@qq.com；2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八三醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津市 300142；3 中國人民武裝警察部隊海南省總隊儋州支隊機(jī)動大隊衛(wèi)生所，海南省五指山市 572200；4 上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海市 201100)

【提要】 細(xì)胞外囊泡是膜狀納米顆粒，其被分成外泌體和微囊泡。兩種類型的細(xì)胞外囊泡均可由多種細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。細(xì)胞外囊泡將核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種來源于母細(xì)胞的信息物質(zhì)包裹其中或攜帶在其膜上，它們可參與細(xì)胞間信號傳遞、蛋白質(zhì)和RNA的遞送等。在外周血樣品中可收集到富含源于神經(jīng)元的細(xì)胞外囊泡，定量檢測其內(nèi)容物可動態(tài)評估創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后機(jī)體的潛在變化。此外，細(xì)胞外囊泡可以加強(qiáng)組織再生、參與免疫調(diào)節(jié)，并可作為干細(xì)胞治療的潛在替代品。本文主要針對細(xì)胞外囊泡及其在TBI診療中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

細(xì)胞外囊泡包含高度保守和快速的細(xì)胞間通信系統(tǒng)，細(xì)胞可以通過該系統(tǒng)及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或核酸等物質(zhì)進(jìn)行信息交流。Wolf[1]首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡參與骨礦化和具有血小板功能，并稱其為“血小板粉塵”。20世紀(jì)80年代早期，細(xì)胞外囊泡的亞型外泌體即被發(fā)現(xiàn)，其可幫助排除細(xì)胞不需要的分子，例如網(wǎng)織紅細(xì)胞在向紅細(xì)胞成熟的過程中通過外泌體排出轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[2]。后續(xù)的研究表明，細(xì)胞外囊泡在免疫系統(tǒng)中具有高度調(diào)節(jié)性，且可參與細(xì)胞間信號通信、蛋白質(zhì)和RNA的遞送等[3]。最近5年，已有研究闡明細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié)生物功能的各種機(jī)制，包括組織穩(wěn)態(tài)、炎癥調(diào)節(jié)、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等。細(xì)胞外囊泡具有極其廣泛的生物學(xué)功能以及在細(xì)胞間穿梭的能力，這為開發(fā)新的診療方法提供了獨(dú)特的平臺。

當(dāng)前，評估創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)的主要手段是神經(jīng)影像學(xué)檢查，但其尚不能確定腦損傷的真實程度，也無法提供繼發(fā)性細(xì)胞死亡、血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥和興奮毒性等信息。研究者可以從外周血樣品中收集富含源于神經(jīng)元的細(xì)胞外囊泡，定量檢測其內(nèi)容物，并以此動態(tài)評估發(fā)生TBI后的潛在變化，輔助臨床醫(yī)師做出適當(dāng)決策；亦可通過細(xì)胞外囊泡運(yùn)輸或遞送具有特殊作用的蛋白質(zhì)、藥物、生物制劑等至靶細(xì)胞，或可促進(jìn)特定功能的修復(fù)。本文介紹細(xì)胞外囊泡的產(chǎn)生、分子組成及其內(nèi)容物作為TBI診療潛在生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，以期幫助臨床醫(yī)生更好地理解和治療TBI。

1 細(xì)胞外囊泡概況

1.1 細(xì)胞外囊泡的結(jié)構(gòu)及特點 細(xì)胞外囊泡幾乎存在于所有生物流體中，包括羊水、血液、尿液、唾液、母乳、腦脊液和腹液等。細(xì)胞外囊泡分為外泌體和微泡，前者源于內(nèi)體/多泡體系統(tǒng)，是直徑為30～150 nm的較小細(xì)胞外囊泡；后者通過質(zhì)膜出芽方式從母細(xì)胞膜表面脫落產(chǎn)生直徑為100～300 nm的較大細(xì)胞外囊泡。兩種類型的細(xì)胞外囊泡均由淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和樹突細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[6]。20世紀(jì)90年代，學(xué)者對細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu)有重大發(fā)現(xiàn)，即外泌體含有的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可允許它們與其他膜蛋白分離并得到純化，這一發(fā)現(xiàn)揭示了外泌體在細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用。

細(xì)胞外囊泡是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，內(nèi)含多種類型蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，包括92 897種蛋白質(zhì)，27 642種mRNA，4 934種微小RNA和584種脂質(zhì)[7]。細(xì)胞外囊泡內(nèi)含的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)特征進(jìn)一步揭示了細(xì)胞外囊泡的功能作用。其中，四跨膜蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白、熱休克蛋白是迄今為止研究較為廣泛的蛋白質(zhì)[5]。Rab家族、膜聯(lián)蛋白和熱休克蛋白在細(xì)胞外囊泡的裝配和運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用；四跨膜蛋白在細(xì)胞遷移、融合、細(xì)胞-細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)方面起重要作用；外泌體中大量存在的整合素可調(diào)節(jié)細(xì)胞外囊泡與其靶細(xì)胞的黏附[8]；此外，磷脂酰絲氨酸參與細(xì)胞外囊泡和質(zhì)膜的信號傳導(dǎo)和融合，并通過不同的磷脂運(yùn)輸酶來耦合細(xì)胞外囊泡膜上表達(dá)的蛋白質(zhì),而單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂和鞘磷脂有利于細(xì)胞外囊泡硬度的形成[9-10]。

1.2 細(xì)胞外囊泡的生物功能 細(xì)胞外囊泡由細(xì)胞分泌，并通過血液、腦脊液、尿液、羊水等生物流體轉(zhuǎn)運(yùn)，其在細(xì)胞間通信和啟動生理反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞外囊泡表面存在主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類和Ⅱ類分子，它們由抗原呈遞細(xì)胞分泌，并通過激活CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞觸發(fā)特異性免疫應(yīng)答[11]。細(xì)胞外囊泡還攜帶可能被轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸(DNA、信使RNA、環(huán)狀RNA、微小RNA、長鏈非編碼RNA等)等多種母細(xì)胞來源的生物活性成分。例如，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤源性細(xì)胞外囊泡包含的mRNA和微小RNA具有觸發(fā)血管生成的潛力[12]。

細(xì)胞外囊泡參與并影響眾多的生物過程，包括清除細(xì)胞廢物和參與炎癥免疫反應(yīng)、紅細(xì)胞成熟、凝血、血管生成、細(xì)胞存活與凋亡、自噬等[13-14]。細(xì)胞外囊泡通過特異性靶向錨定的方式在細(xì)胞間信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并通過轉(zhuǎn)移信使RNA和K-Ras蛋白發(fā)揮促進(jìn)血栓形成、腫瘤增殖和血管生成的作用。細(xì)胞外囊泡除了具有潛在的益處和生理作用外，還可能參與機(jī)體內(nèi)疾病的傳播。例如，運(yùn)輸錯誤折疊蛋白的細(xì)胞外囊泡在帕金森病的發(fā)病中具有重要作用[15]，在心血管疾病和AIDS等傳染病的傳播中亦有潛在作用[7]。因此，特定類型的細(xì)胞外囊泡有望成為輔助疾病診斷及預(yù)后判斷的新分子標(biāo)記物，并為細(xì)胞治療途徑開辟新思路。

1.3 細(xì)胞外囊泡的分離 從生物樣品中分離細(xì)胞外囊泡的常用方法有以下幾種：(1)離心。利用基于差異或密度梯度的離心法。(2)基于分子大小的色譜-過濾法。根據(jù)樣品中存在的不同生物分子的大小差異來分離細(xì)胞外囊泡。(3)基于蛋白相互作用的聚合物沉淀法。利用細(xì)胞外囊泡和聚合物之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來實現(xiàn)細(xì)胞外囊泡分離。(4)基于抗原-抗體的免疫沉淀法。根據(jù)細(xì)胞外囊泡表面標(biāo)志物蛋白質(zhì)的免疫性進(jìn)行分離，可對所有細(xì)胞外囊泡、甚至不同細(xì)胞類型特異性表面物質(zhì)進(jìn)行選擇[16-18]。

2 神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外囊泡

2.1 腦組織內(nèi)細(xì)胞外囊泡的組裝和釋放 細(xì)胞外囊泡在次級內(nèi)體或多泡體中通過質(zhì)膜內(nèi)吞作用產(chǎn)生，并進(jìn)行細(xì)胞蛋白和RNA物質(zhì)的相關(guān)募集和內(nèi)化。細(xì)胞外囊泡內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA可反映正在進(jìn)行的細(xì)胞活動，為評估細(xì)胞事件提供了一個窗口[5，19]。細(xì)胞外囊泡由細(xì)胞釋放后在間質(zhì)液內(nèi)行進(jìn)到鄰近的細(xì)胞或者通過循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處的目標(biāo)，起到直接或間接的調(diào)節(jié)作用。已有學(xué)者在動物模型以及人類的血漿或血清樣品中發(fā)現(xiàn)并且成功分離出細(xì)胞外囊泡[20]。利用抗原-抗體免疫沉淀技術(shù)可從不同類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中分離出細(xì)胞外囊泡亞型。通過定量評估不同亞型細(xì)胞外囊泡中的蛋白質(zhì)和RNA含量，可評估神經(jīng)功能、疾病狀態(tài)和治療條件的變化[21]。

2.2 細(xì)胞外囊泡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系 星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞均可分泌細(xì)胞外囊泡，其參與再生、突觸功能的調(diào)節(jié)和神經(jīng)元發(fā)育等重要生理過程[22]。類似于其他系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞外囊泡也是細(xì)胞間通信、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞廢物清除、與神經(jīng)細(xì)胞之間信號傳導(dǎo)等生理反應(yīng)的關(guān)鍵參與者[22-23]。最近的研究表明，細(xì)胞外囊泡可能參與促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元之間的信號傳導(dǎo)[24]。例如，來自人體腦脊液或源自小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡可以減輕由Aβ(阿爾茨海默病患者體內(nèi)合成或腦組織產(chǎn)生)引起的突觸可塑性破壞程度[25]；而小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可以促進(jìn)tau蛋白的擴(kuò)散，而抑制細(xì)胞外囊泡合成似乎可以減少這種tau蛋白傳遞[23]。

由于細(xì)胞外囊泡可穿過血腦屏障，可從全身血循環(huán)系統(tǒng)、唾液、尿液等中實時收集并提取，然后量化其內(nèi)含物，故其或可成為具有重要價值的診斷工具。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡可用作為診斷帕金森病、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物，而這些疾病與蛋白質(zhì)錯誤折疊有關(guān)，故可通過發(fā)現(xiàn)并量化源自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外囊泡來評估此類疾病[26]。

3 細(xì)胞外囊泡在TBI診療中的應(yīng)用價值

70%～90%的TBI患者可繼續(xù)發(fā)展為長期的或永久性的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙[7]。目前，TBI患者后期發(fā)展為阿爾茨海默病或帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的易感性尚未明確。因此，我們需要更加易于獲取的生物標(biāo)志物，用于鑒定潛在的病理生理變化，以輔助TBI的早期診斷和優(yōu)化治療。

3.1 細(xì)胞外囊泡在TBI評估中的潛在作用 雖然有關(guān)急性期和更嚴(yán)重類型TBI的血液和腦脊液生物標(biāo)志物的鑒定和表征研究取得了進(jìn)展，但對于不同形式TBI在數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周和數(shù)月內(nèi)發(fā)生的動態(tài)變化，目前仍尚未能闡明。闡釋這些動態(tài)變化有助于了解急性TBI后的病理學(xué)變化，進(jìn)而定義治療性干預(yù)的最佳時間窗，并探尋最適合此窗口期的用藥方案及區(qū)分反應(yīng)最佳的個體[27]。就此而言，血漿中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡或有望用于鑒定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理學(xué)狀態(tài)。最新的研究表明，細(xì)胞外囊泡蛋白譜含有損傷特異性生物標(biāo)志物[28]，其中TBI患者的神經(jīng)元源性細(xì)胞外囊泡中磷酸化tau蛋白水平升高[29]。目前，已可通過檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞和(或)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡來評估神經(jīng)炎性反應(yīng)[30]。因此，通過動態(tài)收集和評估受生理及環(huán)境變化、疾病狀態(tài)影響的細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡，可更加準(zhǔn)確地判斷TBI患者的狀態(tài)。

經(jīng)典TBI生物標(biāo)志物通常被用于單個時間點的病情評估，且不同研究所得的結(jié)論也不盡相同，因此其只能提供頭部損傷后事件的即時情況。當(dāng)前，可根據(jù)細(xì)胞外囊泡表面的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性細(xì)胞標(biāo)記物，相對快速地分離富集血漿中中樞神經(jīng)系統(tǒng)源性的細(xì)胞外囊泡，例如利用神經(jīng)黏附蛋白——神經(jīng)細(xì)胞黏附分子和L1細(xì)胞黏附分子(CD171)分離富集神經(jīng)元細(xì)胞外囊泡，利用谷氨酰胺天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分離富集星形膠質(zhì)細(xì)胞，并通過免疫沉淀收集細(xì)胞外囊泡。目前的技術(shù)可以在單個樣品中重復(fù)量化多蛋白和(或)從TBI傷后生化級聯(lián)反應(yīng)中提取RNA，這使我們能夠更加深入地動態(tài)探析TBI傷后疾病進(jìn)展機(jī)制、宿主對TBI的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)以及治療方案療效。將經(jīng)典的標(biāo)志物與細(xì)胞外囊泡結(jié)合進(jìn)行動態(tài)評估，并通過細(xì)胞、動物實驗和探索性臨床試驗驗證，有望為TBI和其他神經(jīng)變性疾病提供真正有用的生物標(biāo)志物。但這些細(xì)胞外囊泡與經(jīng)典的血漿和(或)腦脊液源性TBI標(biāo)記物之間的具體關(guān)系，尚有待進(jìn)一步闡明。

3.2 細(xì)胞外囊泡在TBI干預(yù)中的潛在作用 細(xì)胞外囊泡可釋放RNA和蛋白到其母細(xì)胞周圍的局部微環(huán)境或經(jīng)體循環(huán)遠(yuǎn)程傳遞至靶細(xì)胞(器官)，從而為細(xì)胞間信號的傳導(dǎo)提供有效機(jī)制[31]。細(xì)胞外囊泡可通過受體-配體作用、抗原呈遞等多種方式與受體細(xì)胞相互作用或結(jié)合。此外，細(xì)胞外囊泡可附著并融合入其靶細(xì)胞或通過內(nèi)吞作用內(nèi)化。無論何種交互機(jī)制，現(xiàn)已證實細(xì)胞外囊泡的內(nèi)容物可在被轉(zhuǎn)移后的新位置處起作用。例如，大鼠細(xì)胞外囊泡中的信使RNA可被提取并成功移植入人體細(xì)胞內(nèi)[32]；含有小干擾RNA的細(xì)胞外囊泡被注入小鼠后可將小干擾RNA傳遞至靶組織[33]。因此，通過細(xì)胞外囊泡運(yùn)輸或遞送具有特殊作用的蛋白質(zhì)、藥物、生物制劑等至靶細(xì)胞，或可促進(jìn)特定功能的修復(fù)。Kim等[34]研究發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞瘤源性細(xì)胞外囊泡可成功降低關(guān)節(jié)炎患者機(jī)體的炎性和自我免疫反應(yīng)。近期有關(guān)TBI動物模型的研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕模式分離和空間學(xué)習(xí)障礙，促進(jìn)神經(jīng)及血管生成，降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)[35]。

4 小 結(jié)

目前，細(xì)胞外囊泡因其所有的功能已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。通過動態(tài)收集和評估受生理、環(huán)境變化、疾病狀態(tài)影響的細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡可更加準(zhǔn)確地判斷TBI患者狀態(tài)，或通過細(xì)胞外囊泡幫助運(yùn)輸或遞送具有特殊作用的蛋白質(zhì)、藥物、生物制劑等至靶細(xì)胞可促進(jìn)特定功能修復(fù)。細(xì)胞外囊泡在TBI診療領(lǐng)域的應(yīng)用處于起步階段，仍有許多難題需要攻克，但正在進(jìn)行的細(xì)胞外囊泡生產(chǎn)優(yōu)化和細(xì)胞外囊泡內(nèi)容物、生物學(xué)功能剖析的研究，有望使細(xì)胞外囊泡成為高效多功能的診療平臺。