疏肝清熱通絡(luò)方對糖尿病大鼠脂肪酸合成酶及心肌AMPK/ eNOS 信號通路的影響

王坤玲，連 軍，周詩穎，李 林

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，烏魯木齊 830011）

2 型糖尿病患者機(jī)體血糖水平長期處于異常狀態(tài)，常會引起體內(nèi)血脂代謝異常，誘發(fā)或加重機(jī)體內(nèi)多種臟器的炎癥損傷，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)及功能受損[1-2]。FAS 是與機(jī)體脂肪生成及代謝密切相關(guān)的代謝酶，主要分布于肝臟及脂肪組織中，并以在肝臟中表達(dá)為主[3]。AMPK/eNOS 信號通路及其相關(guān)蛋白水平異常與糖尿病及心肌損傷的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。疏肝清熱通絡(luò)方是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，治療2 型糖尿病療效顯著[6]，而其對于脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響目前尚未見報(bào)道。本研究觀察疏肝清熱通絡(luò)方對于2 型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響，以期為疏肝清熱通絡(luò)方對于脂肪代謝及心肌損傷的保護(hù)作用研究提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級成年雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 疏肝清熱通絡(luò)方（SQT）（柴胡15 g，郁金10 g，黃芩10 g，黃連10 g，大黃10 g，芍藥10 g，當(dāng)歸6 g，丹參10 g，水蛭10 g）由藥材飲片制成每毫升含1 g 生藥的制劑，購于北京同仁堂股份有限公司（批號：201903282）；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國 Sigma 公司（批號：201907131）；SOD 活性檢測試劑盒及MDA 檢測試劑盒，AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗體購自碧云天生物科技有限公司（貨號：S0103、S0131M、AF1627、AF2677、AF6792、AF5812、AF1186）；磷酸酶抑制劑復(fù)合物購自上海生工生物公司（貨號PL107）；糖化血紅蛋白酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：201812112）。

1.3 主要儀器 DM500 顯微鏡購自德國Leica 公司；AllegraX30R 多功能離心機(jī)購自美國Beckman 公司；Multiskan GO 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher 公司；ChemiDoc XRS 型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；ACCU-CHEK Active 血糖儀購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.4 造模與分組 除15 只大鼠作為對照組外，其余60 只大鼠參照文獻(xiàn)[7]建立2 型糖尿病模型大鼠。具體方法為：給予大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，根據(jù)大鼠體質(zhì)量按照25 mg/kg 腹腔注射1% STZ，1 周后按照40 mg/kg 再次腹腔注射給予大鼠1% STZ，常規(guī)喂養(yǎng)3 d 后自尾靜脈采血，使用血糖儀測定血糖，連續(xù)3 d 大鼠血糖濃度均＞16.7 mmol/L 以及尿糖達(dá)+++～++++視為2 型糖尿病大鼠模型建立成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 將造模完成后的大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、SQT 低、中、高劑量組，15 只/組。以SQT 的臨床使用劑量為參考，通過劑量換算后[8]，SQT 低、中、高劑量組大鼠分別根據(jù)大鼠體質(zhì)量按照10、20、30 g/kg 的劑量灌胃予大鼠SQT，對照組及模型組灌胃予大鼠等量生理鹽水，每日1 次，連續(xù)給藥8 周[9]。最后1 次給藥24 h 后，大鼠禁食不禁水12 h 后，尾靜脈取血后使用血糖儀檢測大鼠空腹血糖水平。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠糖化血紅蛋白水平測定 大鼠通過眼眶后靜脈叢取血，按照ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠糖化血紅蛋白水平。

1.6.2 大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平測定 取大鼠血清，進(jìn)樣至全自動(dòng)生化分析儀，測定大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平。

1.6.3 大鼠肝組織FAS mRNA水平測定 大鼠處死后分離肝組織，提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR檢測肝組織FAS mRNA 水平。引物序列為：FAS，正向引物：5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′，反向引物：5′-GGACCACCCGGGCCATAGGT-3′；β-actin，正向引物：5′-AGAGTCGCGAGCTTGATCTT-3′，反向引物：5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTG-3′，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6.4 大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平測定 取大鼠心肌組織，按照試劑盒說明書檢測心肌組織SOD活性及MDA 水平。

1.6.5 大鼠心肌組織病理學(xué)檢查 取心肌組織，在中性甲醛中固定，石蠟包埋，并進(jìn)行5 μm 切片，按照蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）步驟進(jìn)行染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化。

1.6.6 Western blot 檢測大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平 取大鼠心肌組織加入RIPA 蛋白裂解液及磷酸酶抑制劑，在玻璃勻漿器勻漿，4 ℃，12 000 rpm 離心10 min，取上清液于100 ℃水浴5 min 變性處理，BCA 法測定蛋白濃度后，取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜。封閉液室溫封閉1 h 后，經(jīng)AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗體（1:1 000）4 ℃孵育過夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1:2 000）室溫條件下再次孵育1 h，PBST 清洗后在蛋白條帶上加入顯色液顯影，并利用凝膠成像儀成像后，應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行免疫印跡灰度值定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Graphpad prism 5 繪圖，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較 見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較（，n =15）

表1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較 見表2。

表2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較（，n =15）

表2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較（，n =15）

表3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較 見表4。

表4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較（，n =15）

表4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.5 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞排列不整齊，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肌原纖維結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重；與模型組相比，SQT 各劑量組大鼠心肌組織病理學(xué)明顯改善，SQT 低、中劑量組大鼠心肌組織細(xì)胞膜完整，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，肌原纖維結(jié)構(gòu)有所改善，SQT 高劑量組大鼠心肌細(xì)胞膜完整，偶見炎性細(xì)胞浸潤，肌原纖維結(jié)構(gòu)完整。見圖1。

2.6 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，SQT 低、中、高劑量組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、peNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均顯著升高（P＜0.05），且隨著SQT 劑量的增加，大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、peNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平逐漸升高。見圖2，圖3。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE 染色，×200）

圖2 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平比較

圖3 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平

3 討論

2 型糖尿病是指機(jī)體內(nèi)胰島素作用減弱造成胰島素相對缺乏的狀態(tài)，從而引起體內(nèi)血糖代謝紊亂。糖尿病患者通常伴隨著血脂代謝異常，造成血管平滑肌及內(nèi)膜引起炎癥損傷，進(jìn)一步引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌損傷等多種心血管疾病。FAS 主要分布在肝臟及脂肪組織中，與脂肪合成密切相關(guān)的一種代謝酶，主要參與脂肪酸合成過程中轉(zhuǎn)酰、縮合、還原、脫水和再還原等關(guān)鍵過程[10-11]。

eNOS 是調(diào)控血管內(nèi)皮釋放一氧化氮（NO）的關(guān)鍵基因，當(dāng)eNOS 水平降低時(shí)，血管內(nèi)皮NO 釋放就會減少，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂及收縮功能障礙，引起心肌細(xì)胞損傷[12]。AMPK 是體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)激酶，在控制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，脂肪酸氧化和脂質(zhì)合成等過程中發(fā)揮重要作用，并能夠調(diào)控eNOS 基因表達(dá)，影響NO 水平[13]。

中醫(yī)學(xué)將糖尿病定義為消渴，中醫(yī)理論認(rèn)為糖尿病的發(fā)病機(jī)制為肝失調(diào)暢、氣機(jī)不暢，痰濕不行，血液瘀滯。疏肝清熱通絡(luò)方是以柴胡、郁金等多種中藥材組成的成方制劑，柴胡、郁金疏肝解郁，柴胡與芍藥合用則調(diào)理肝氣，黃芩、黃連清熱瀉火，當(dāng)歸、白芍、大黃、丹參、水蛭活血化瘀通絡(luò)，全方共奏辛開苦降、調(diào)暢氣機(jī)、化瘀通絡(luò)功效。本研究通過觀察疏肝清熱通絡(luò)方（SQT）對2 型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響，因目前臨床中尚未有作用機(jī)制明確的，用于治療糖尿病大鼠心肌損傷AMPK/ eNOS 信號通路調(diào)節(jié)劑，故本實(shí)驗(yàn)未使用陽性對照藥物。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，SQT 低、中、高劑量組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平明顯降低，且與SQT 的劑量表現(xiàn)出依賴性，提示疏肝清熱通絡(luò)方能夠呈劑量依賴性的降低大鼠血糖水平，影響大鼠體內(nèi)糖代謝。血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平是反映機(jī)體內(nèi)血脂水平的關(guān)鍵指標(biāo)，肝臟FAS mRNA水平則體現(xiàn)了肝臟脂肪的合成能力，間接反映了機(jī)體內(nèi)血脂的代謝水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SQT 各劑量組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平、肝組織FAS mRNA 水平較模型組明顯降低，表明疏肝清熱通絡(luò)方能夠通過影響糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶的表達(dá)水平，進(jìn)而影響其體內(nèi)活性，干擾糖尿病大鼠體內(nèi)脂肪的合成，改善糖脂代謝異常。MDA 水平及SOD 活性是反映組織器官氧化應(yīng)激水平的常用指標(biāo)，MDA 水平升高及SOD 活性降低，均能提示機(jī)體處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)及自我修復(fù)能力下降。本研究發(fā)現(xiàn)，SQT 各劑量大鼠心肌組織MDA 水平明顯降低，SOD活性、AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS及p-eNOS蛋白水平較模型組均明顯升高，大鼠心肌組織病理學(xué)變化明顯改善，提示疏肝清熱通絡(luò)方能夠抑制糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體損傷修復(fù)能力，并改善心肌的組織病理學(xué)變化，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/eNOS 信號通路有關(guān)。

綜上所述，疏肝清熱通絡(luò)方能夠明顯降低2 型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，抑制脂肪酸合成酶基因的表達(dá)，激活A(yù)MPK/eNOS 信號通路，改善大鼠心肌氧化應(yīng)激水平及組織病理學(xué)變化。