• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    去甲斑蝥素增強(qiáng)人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的機(jī)制研究

    2021-05-28 08:36:58馮曉丹
    吉林中醫(yī)藥 2021年5期
    關(guān)鍵詞:去甲貨號(hào)懸液

    馮曉丹,毛 雪,王 英,董 秀*

    (1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,沈陽(yáng) 110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心,沈陽(yáng) 110847)

    卵巢癌是一種具有復(fù)雜分子和基因變化的異質(zhì)性疾病,由于其缺乏有效預(yù)防措施、篩查工具及無(wú)癥狀發(fā)展的特點(diǎn),使其多在癌癥晚期才得以確診,且極易在根治性手術(shù)和化療后復(fù)發(fā),故在婦科惡性腫瘤中病死率極高[1]。順鉑(cisplatin,DDP)是第一代鉑類抗癌藥物,對(duì)于包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥均有顯著的抗癌作用,臨床運(yùn)用廣泛,但順鉑的內(nèi)源性和獲得性耐藥極易造成患者后期療效不佳,增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),而對(duì)正常細(xì)胞過(guò)高的毒副作用,也限制了順鉑的臨床用藥,故順鉑與其他抗癌藥物聯(lián)合治療已成為許多癌癥的新治療策略[2]。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是蟲類中藥提取物斑蝥素的衍生物,是近年來(lái)抗癌藥物的新起之秀,其多靶點(diǎn)、增強(qiáng)免疫反應(yīng)[3]、逆轉(zhuǎn)耐藥[4]等優(yōu)勢(shì),是與順鉑聯(lián)合用藥的較好選擇。本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用流式細(xì)胞分析、熒光染色和Western blot 方法檢測(cè)去甲斑蝥素能否增強(qiáng)順鉑對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞敏感性,為臨床用藥提供新的治療策略和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)去甲斑蝥素(N8784);順鉑(貨號(hào):P4394-25MG)(美國(guó)Sigma 公司);胎牛血清(FBS)、PBS 磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640 培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone 公司);MTT(貨號(hào):M8180),二甲基亞砜DMSO(貨號(hào):D8372),SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(貨號(hào):P1200),普通RIPA 裂解液(組織/細(xì)胞)(貨號(hào):R0020),BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):PC0020)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;Annexin-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒(KC0001)購(gòu)于ImmunoWay Biotechnology;Mito-Tracker Green(線粒體綠色熒光探針)(貨號(hào):C1048)購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 將人卵巢癌細(xì)胞珠SKOV3 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中,放入5% CO2、37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),在培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量,及時(shí)換液、傳代,適時(shí)進(jìn)行凍存,保留實(shí)驗(yàn)備用。

    1.3 MTT 法檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)SKOV3 細(xì)胞活性的影響 將細(xì)胞消化,制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后按2 000 個(gè)/孔,200 uL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)。次日,按正常對(duì)照組、去甲斑蝥素30 μmol/L 組,順鉑10 μg/mL組、去甲斑蝥素30 μmol/L+順鉑10 μg/mL 組依次加藥,37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,48 h,72 h。取出96孔培養(yǎng)板,避光下,每孔加入MTT 工作液25 uL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔中培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150 uL,搖床上震蕩10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm 測(cè)定其吸光度值。抑制率(%)=(A490對(duì)照-A490給藥)/(A490對(duì)照-A490空白)× 100%

    1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將SKOV3 卵巢癌的單細(xì)胞懸液以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。次日,待細(xì)胞貼壁后按1.3 進(jìn)行分組加藥,計(jì)時(shí)至指定時(shí)間,將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸出保留,用特定胰蛋白酶(不含EDTA)消化,加入保留的原培養(yǎng)液吹打,用以制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min,棄上清,加PBS重懸計(jì)數(shù)。離心,以400 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)。加入5 μL 的Annexin V-FITC 結(jié)合液,4 ℃,避光,15 min。加入10 μL 的PI 染色液,4 ℃,避光,5 min。室溫下放搖床上震蕩避光孵育15 min,而后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.5 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)變化和分布 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞,經(jīng)洗滌、消化后按照每孔400 μL 細(xì)胞懸液約8 000 個(gè)細(xì)胞接種48 孔板。次日,按1.3 加藥處理,每孔給藥400 μL。在藥物作用指定時(shí)間后吸出原培養(yǎng)液,加入提前37 ℃預(yù)溫培育的終濃度為200 nM 的Mito-Tracker Green 工作液,培養(yǎng)箱避光孵育40 min,去除Mito-Tracker Green 工作溶液,加入37 ℃預(yù)溫培育的新細(xì)胞培養(yǎng)液,在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照、記錄。

    1.6 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞懸液以濃度5×105個(gè)細(xì)胞/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日,按1.3 分組加藥,藥物作用指定時(shí)間后,在冰上經(jīng)PBS 淋洗、裂解液裂解后提取蛋白。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,蛋白變性后凍存待用。將變性的等量蛋白加入SDS-PAGE 凝膠孔中。用12% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì),分離完畢后以濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。將膜放入5%的脫脂牛奶中,室溫封閉1 h,TBST 清洗2 次,加入一抗孵育,放置4 ℃冰箱中,孵育過(guò)夜。次日,用TBST洗膜4 次,每次10 min,添加二抗,室溫孵育1 h 。加入ECL 發(fā)光液后曝光,掃描記錄圖像。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。各組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析,以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 分別加入去甲斑蝥素(30 μmol/L)、順鉑(10 μg/mL)和去甲斑蝥素(30 μmol/L)+順鉑(10 μg/mL)作用于卵巢癌細(xì)胞,分別于24、48、72 h 檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。如圖1 所示,去甲斑蝥素和順鉑聯(lián)合用藥后,去甲斑蝥素可有效提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,在24 h 的生長(zhǎng)抑制作用最為理想。

    圖1 NCTD 聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

    2.2 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在早期凋亡中,去甲斑蝥素能明顯增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用。相較于去甲斑蝥素(30 μmol/L)、順鉑(10 μg/mL)單獨(dú)用藥組,去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥組(30 μmol/L+10 μg/mL)的細(xì)胞凋亡率明顯升高。見圖2,圖3。

    圖2 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥的流式分析結(jié)果

    圖3 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(,n =3)

    2.3 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變 在用Mito-Tracker Green 特異性標(biāo)記去甲斑蝥素(30 μmol/L)、順鉑(10 μg/mL)和去甲斑蝥素+順鉑(30 μmol/L+10 μg/mL)用藥后卵巢癌細(xì)胞中的線粒體發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組細(xì)胞中線粒體形態(tài)相比,去甲斑蝥素(30 μmol/L)與順鉑(10 μg/mL)單獨(dú)用藥組出現(xiàn)少部分呈點(diǎn)塊狀形態(tài)的線粒體,而去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥組細(xì)胞中點(diǎn)塊狀線粒體數(shù)量明顯增加,聚集分布于核周,具有顯著差異性,提示去甲斑蝥素促進(jìn)了順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變,見圖4。

    2.4 去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞中procaspase-3 蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)用藥后卵巢癌細(xì)胞中procaspase-3 蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組比較,在去甲斑蝥素(30 μmol/L)與順鉑(10 μg/mL)組中均出現(xiàn)不同程度的procaspase-3蛋白表達(dá)下降,而去甲斑蝥素與順鉑(30 μmol/L+10 μg/mL)聯(lián)合用藥組中procaspase-3 蛋白表達(dá)下降程度增加,見圖5。

    圖4 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變(線粒體熒光染色)

    圖5 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥對(duì)procaspse-3 表達(dá)的影響

    3 討論

    隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,有了更好的手術(shù)技術(shù)和更多的化療方案,但臨床目前使用的對(duì)卵巢癌一線化療反應(yīng)良好的鉑類化合物和紫杉烷類藥物,仍會(huì)在大多數(shù)患者中出現(xiàn)復(fù)發(fā)和化療耐藥現(xiàn)象[5]。探索改善一線治療藥物療效和化療藥物后期療效的方法勢(shì)在必行。凋亡是指在多種基因調(diào)控下細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程[6-8],在清除不穩(wěn)定基因或異常生長(zhǎng)的細(xì)胞方面中起著至關(guān)重要的作用,是機(jī)體發(fā)育和維持體內(nèi)平衡的重要途徑。通常,癌癥的發(fā)生多與癌細(xì)胞避開凋亡這一程序性死亡途徑相關(guān)[9],故抗癌藥物多是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、縮小瘤體實(shí)現(xiàn)抗癌的目的[10-12]。去甲斑蝥素是蟲類中藥斑蝥提取物斑蝥素的衍生物,對(duì)于多種癌細(xì)胞均有顯著的抑制作用。去甲斑蝥素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式有多種,既可以觸發(fā)線粒體途徑誘導(dǎo)黑色素瘤[13]、人前列腺癌[14]和胃癌[15]細(xì)胞凋亡,又可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人腎癌[16]細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)[17]證明去甲斑蝥素能通過(guò)抑制c-met 蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞A549/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥,增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

    本課題組前期實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證去甲斑蝥素對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的抑制作用,當(dāng)去甲斑蝥素作用于卵巢癌細(xì)胞后可使促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)水平上升,抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達(dá)水平下調(diào)以及procaspase-3 的表達(dá)降低,同時(shí)還可以通過(guò)介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生引起G2/M 期的調(diào)控因子p21 蛋白表達(dá)上調(diào)和cyclin B1 蛋白表達(dá)下調(diào),調(diào)控細(xì)胞周期,誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn),去甲斑蝥素能有效促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞活性。這一結(jié)果與郭紀(jì)偉等[19]在去甲斑蝥素作用于肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中結(jié)果相同,即去甲斑蝥素增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。在用Mito-Tracker Green 線粒體綠色熒光探針染色實(shí)驗(yàn)中,去甲斑蝥素和順鉑聯(lián)合用藥可明顯破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài),可能與去甲斑蝥素作用于卵巢癌細(xì)胞后ROS 水平升高,Bax/ Bcl-2 比率上調(diào)誘發(fā)線粒體損傷相關(guān)。在既往的研究中顯示,高水平的ROS 可以引發(fā)線粒體損傷,介導(dǎo)線粒體凋亡途徑的,ROS 可引發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,進(jìn)而引起線粒體跨膜電位降低,釋放細(xì)胞色素C,引發(fā)Caspase 的級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)腫瘤凋亡[20]。Bax/Bcl-2 比率上調(diào)可以引發(fā)線粒體膜電位崩潰,釋放細(xì)胞色素C,活化Caspase 引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21-22]。故可從以上2 個(gè)方面,對(duì)去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥損傷卵巢癌細(xì)胞線粒體機(jī)制進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充證明。

    Caspase 家族在細(xì)胞凋亡的起始和執(zhí)行中都發(fā)揮重要作用,其中就包含第一個(gè)被信號(hào)激活的啟動(dòng)者Caspase(Caspase-2,-8,-9 和-10)和執(zhí)行凋亡任務(wù)的執(zhí)行者Caspase(Caspase-3,-6 和-7),許多傳統(tǒng)的癌癥療法都是通過(guò)間接激活這些Caspases 來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以清除癌細(xì)胞[23-24]。研究顯示在大多腫瘤細(xì)胞中,如淋巴瘤、白血病等,由于凋亡被抑制,凋亡的執(zhí)行者Caspase-3 的酶原procaspase-3,會(huì)在腫瘤中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,通常Caspase-3是以procaspase-3的形式存在,只有在接受到凋亡信號(hào)時(shí)才會(huì)被活化為Caspase-3 執(zhí)行凋亡指令[25-26]。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,去甲斑蝥素、順鉑組均可減少細(xì)胞內(nèi)procaspase-3蛋白的表達(dá),順鉑和去甲斑蝥素聯(lián)合用藥顯著降低了細(xì)胞內(nèi)procaspase-3 蛋白的表達(dá),抑制了腫瘤的發(fā)生,提示聯(lián)合用藥后藥物可能依賴Caspase 途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,去甲斑蝥素在卵巢癌的體外實(shí)驗(yàn)中,可促進(jìn)順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用,為臨床去甲斑蝥素輔助順鉑治療卵巢癌提供了新的理論依據(jù)和研究方向。

    猜你喜歡
    去甲貨號(hào)懸液
    去甲腎上腺素聯(lián)合山莨菪堿治療感染性休克的療效觀察
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    作者更正致歉說(shuō)明
    磺胺嘧啶銀混懸液在二度燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用
    薯蕷皂苷元納米混懸液的制備
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:28
    立體選擇性合成內(nèi)型N-Boc-N-去甲托品醇
    霧化吸入布地奈德混懸液治療COPD急性加重期的效果觀察
    多巴胺、去甲腎上腺素對(duì)于重癥感染性休克患者血乳酸清除率及死亡率的影響
    去甲斑蝥素抑制大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的研究
    美國(guó)FDA批準(zhǔn)達(dá)蘆那韋口服混懸液上市
    亚洲国产精品成人久久小说 | 国产伦在线观看视频一区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | av专区在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 99热这里只有精品一区| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品久久电影中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜福利高清视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 性色avwww在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 91久久精品国产一区二区成人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲专区国产一区二区| 国产精品国产高清国产av| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲欧美日韩东京热| 不卡视频在线观看欧美| 免费看光身美女| 久久鲁丝午夜福利片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 色综合色国产| 日本成人三级电影网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av在线老鸭窝| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费人成在线观看视频色| av专区在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产午夜精品论理片| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜日韩欧美国产| 在线播放无遮挡| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费黄网站久久成人精品| 51国产日韩欧美| 国产精品一二三区在线看| 精品日产1卡2卡| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久色成人| 国产中年淑女户外野战色| 一级av片app| 精品久久久久久久久久久久久| 国产av一区在线观看免费| 亚洲在线观看片| 精品国内亚洲2022精品成人| 在线国产一区二区在线| 色5月婷婷丁香| 亚洲最大成人中文| 日本成人三级电影网站| 欧美三级亚洲精品| 国产极品精品免费视频能看的| 国产老妇女一区| 两个人的视频大全免费| 九九在线视频观看精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 在线观看午夜福利视频| 国产淫片久久久久久久久| 毛片女人毛片| 精品无人区乱码1区二区| 最近在线观看免费完整版| 麻豆国产av国片精品| 国产精品一区www在线观看| 午夜激情欧美在线| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久性生活片| 少妇熟女欧美另类| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲不卡免费看| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人美女网站在线观看视频| 免费观看精品视频网站| 国产午夜精品论理片| h日本视频在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产老妇女一区| 国产成人精品久久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 村上凉子中文字幕在线| 日韩中字成人| 国产不卡一卡二| 一进一出好大好爽视频| 久久热精品热| 嫩草影视91久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本在线视频免费播放| 天堂网av新在线| 不卡视频在线观看欧美| 国产高清不卡午夜福利| 成年女人看的毛片在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品日韩av片在线观看| 丰满的人妻完整版| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产乱人视频| 一区福利在线观看| 日韩欧美三级三区| 日韩欧美免费精品| 成人无遮挡网站| 51国产日韩欧美| 色尼玛亚洲综合影院| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩精品中文字幕看吧| 91久久精品电影网| 久久精品国产自在天天线| 少妇人妻一区二区三区视频| eeuss影院久久| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一区二区三区免费毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费av观看视频| 99久久九九国产精品国产免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 嫩草影视91久久| 日本 av在线| 亚洲无线在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 免费黄网站久久成人精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 嫩草影视91久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 俄罗斯特黄特色一大片| 插阴视频在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久久久中文| 国产视频一区二区在线看| 97碰自拍视频| 国产高清激情床上av| 五月玫瑰六月丁香| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产淫片久久久久久久久| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜视频国产福利| 又黄又爽又免费观看的视频| 我的老师免费观看完整版| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲91精品色在线| 深爱激情五月婷婷| 久久久色成人| 中文字幕免费在线视频6| 青春草视频在线免费观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 不卡一级毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产一区二区激情短视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品一区二区三区视频在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 免费av不卡在线播放| 久久热精品热| 久久久久久久久久黄片| 69人妻影院| 欧美3d第一页| 亚洲人成网站在线播| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲成人av在线免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| 哪里可以看免费的av片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲成人久久爱视频| 日本一本二区三区精品| 久久鲁丝午夜福利片| 高清午夜精品一区二区三区 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 黄片wwwwww| 丰满乱子伦码专区| 亚洲最大成人手机在线| 极品教师在线视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 99热这里只有是精品50| 日韩欧美在线乱码| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久午夜电影| 国内精品宾馆在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩欧美在线乱码| 国产高清视频在线播放一区| 久久99热这里只有精品18| 丰满乱子伦码专区| 亚洲av免费高清在线观看| 国产在视频线在精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 综合色丁香网| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲av不卡在线观看| 日韩成人伦理影院| 两个人的视频大全免费| 亚洲av美国av| 久久午夜福利片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲无线观看免费| 日韩精品青青久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费人成视频x8x8入口观看| 极品教师在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 午夜福利18| 欧美性感艳星| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品久久久久久久久久免费视频| 色综合色国产| 美女免费视频网站| 日韩强制内射视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人a区在线观看| 亚洲电影在线观看av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 嫩草影院精品99| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久精品大字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费av毛片视频| 日韩av在线大香蕉| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产免费一级a男人的天堂| 97超视频在线观看视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品久久电影中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产久久久一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品国产三级普通话版| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜精品国产一区二区电影 | 变态另类丝袜制服| 午夜福利在线观看吧| 成年av动漫网址| 国产精品国产高清国产av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久国产成人精品二区| 欧美+日韩+精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲av.av天堂| 精品欧美国产一区二区三| 国产探花在线观看一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲18禁久久av| 麻豆成人午夜福利视频| 观看免费一级毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜免费激情av| 淫妇啪啪啪对白视频| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲内射少妇av| 国产真实乱freesex| 国产精品野战在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 99热全是精品| 日本熟妇午夜| 欧美bdsm另类| 欧美成人a在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲经典国产精华液单| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美zozozo另类| 欧美高清性xxxxhd video| 成年版毛片免费区| av天堂在线播放| 成人漫画全彩无遮挡| 久久99热6这里只有精品| 国产午夜精品论理片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久成人免费电影| 高清毛片免费观看视频网站| 国产色婷婷99| 成人av一区二区三区在线看| 长腿黑丝高跟| 亚洲四区av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲性夜色夜夜综合| 女人被狂操c到高潮| 黄色配什么色好看| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜免费激情av| 成人美女网站在线观看视频| av.在线天堂| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产亚洲精品av在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产69精品久久久久777片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 蜜臀久久99精品久久宅男| av在线天堂中文字幕| a级毛色黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品久久久久久久久亚洲| 六月丁香七月| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧美精品自产自拍| 麻豆国产97在线/欧美| 色视频www国产| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美激情在线99| 又爽又黄a免费视频| 悠悠久久av| 亚洲国产欧美人成| a级毛色黄片| 黄色日韩在线| 十八禁网站免费在线| 99久久精品国产国产毛片| av专区在线播放| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久久久久av不卡| 观看免费一级毛片| 国产乱人视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av不卡在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲最大成人手机在线| 在线国产一区二区在线| 久久精品国产自在天天线| 免费搜索国产男女视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产高清视频在线播放一区| 69人妻影院| 直男gayav资源| 男女啪啪激烈高潮av片| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 12—13女人毛片做爰片一| 我要看日韩黄色一级片| 天堂影院成人在线观看| h日本视频在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 悠悠久久av| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美另类亚洲清纯唯美| 永久网站在线| av在线天堂中文字幕| 校园春色视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日本一本二区三区精品| 午夜福利在线在线| 免费搜索国产男女视频| 亚洲在线观看片| 国产三级在线视频| 久久午夜福利片| 在线国产一区二区在线| 日韩精品有码人妻一区| 久久久色成人| 亚洲无线观看免费| 热99在线观看视频| 老司机影院成人| 特级一级黄色大片| 日韩欧美三级三区| 又爽又黄无遮挡网站| 高清午夜精品一区二区三区 | 成人特级av手机在线观看| 在线播放国产精品三级| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲色图av天堂| 亚洲内射少妇av| 极品教师在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 一区二区三区四区激情视频 | 免费人成在线观看视频色| 少妇被粗大猛烈的视频| 日本欧美国产在线视频| 看片在线看免费视频| 久久99热这里只有精品18| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av五月六月丁香网| 五月玫瑰六月丁香| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产欧美日韩精品一区二区| 草草在线视频免费看| 一进一出抽搐动态| 在线观看66精品国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 99热精品在线国产| 久久这里只有精品中国| 国产淫片久久久久久久久| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久久久久午夜电影| av黄色大香蕉| 精品人妻视频免费看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 男女那种视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产三级中文精品| 日本一二三区视频观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 哪里可以看免费的av片| 色尼玛亚洲综合影院| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品夜色国产| 精品不卡国产一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 免费一级毛片在线播放高清视频| 香蕉av资源在线| 如何舔出高潮| 别揉我奶头 嗯啊视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 一区二区三区免费毛片| 欧美人与善性xxx| 久久精品影院6| 丝袜喷水一区| 最新中文字幕久久久久| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美zozozo另类| 国产亚洲精品av在线| 波多野结衣高清作品| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲av中文av极速乱| 国模一区二区三区四区视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美一级a爱片免费观看看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费在线观看成人毛片| 久久久午夜欧美精品| 精品国产三级普通话版| 国产日本99.免费观看| av在线亚洲专区| 成年女人永久免费观看视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产成人91sexporn| 亚洲美女搞黄在线观看 | 51国产日韩欧美| 一级黄色大片毛片| 国产精品女同一区二区软件| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线免费观看的www视频| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av中文av极速乱| 精品人妻熟女av久视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日韩成人伦理影院| 床上黄色一级片| 免费观看精品视频网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 又爽又黄a免费视频| 午夜a级毛片| 亚洲精品456在线播放app| 大型黄色视频在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国模一区二区三区四区视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av不卡在线观看| 色在线成人网| 免费在线观看成人毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久国产成人免费| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美精品免费久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚州av有码| 级片在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精华霜和精华液先用哪个| 99热这里只有是精品在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美精品自产自拍| av卡一久久| 国产黄片美女视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久久久免费精品人妻一区二区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国产高清激情床上av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产视频内射| 亚洲真实伦在线观看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久色成人| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久久精品国产国产毛片| 免费观看在线日韩| 免费观看的影片在线观看| 国产视频一区二区在线看| 最后的刺客免费高清国语| 看十八女毛片水多多多| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 人人妻人人看人人澡| 亚洲18禁久久av| 亚洲不卡免费看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日本黄色片子视频| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲成人久久性| 亚洲18禁久久av| 老司机福利观看| 永久网站在线| 一本一本综合久久| 国产高潮美女av| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产精品伦人一区二区| 日本色播在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品一及| 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费高清视频大片| 国产伦精品一区二区三区四那| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲av熟女| 成年版毛片免费区| 欧美zozozo另类| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一边摸一边抽搐一进一小说| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 成人性生交大片免费视频hd| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 久久精品人妻少妇| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩欧美精品v在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产大屁股一区二区在线视频| 在线免费观看的www视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲性久久影院| 91在线精品国自产拍蜜月| 一个人看的www免费观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| 久久热精品热| 日本黄色片子视频| 热99在线观看视频| 日韩强制内射视频| 少妇的逼水好多| 淫秽高清视频在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 天美传媒精品一区二区| 三级经典国产精品| 俺也久久电影网| 国产成人精品久久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 欧美日韩在线观看h| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 特级一级黄色大片| 欧美在线一区亚洲| 欧美三级亚洲精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲自拍偷在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品,欧美在线|