濕熱中阻方對(duì)脾胃濕熱證小鼠氧化應(yīng)激和炎癥因子影響研究

段繼昌，曹 路，柴晶美，魏 巖，周麗雅

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

近年來(lái)，隨著高脂、高糖等飲食攝入的增加，脾胃濕熱證的患者逐年增多。濕熱中阻方是周麗雅教授臨床治療脾胃濕熱證的自擬方，臨床治療多種與脾胃濕熱相關(guān)的疾病取得了良好的臨床療效。脾胃濕熱證主要有脘腹痞悶、厭食油膩、嘔惡納呆、大便臭晦黏膩、小便黃、苔膩等癥狀，常見(jiàn)于慢性乙型肝炎[1]、慢性胃炎[2]、胃癌[3]、肝癌[4]、潰瘍性結(jié)腸炎[5]等多種消化系統(tǒng)疾病，具有病機(jī)復(fù)雜、纏綿難愈、治療難度大等特點(diǎn)[6]。研究[7]顯示，脾胃濕熱證的發(fā)病機(jī)制與炎癥病變密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)是一種自我防御過(guò)程，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，引發(fā)疾病?，F(xiàn)代研究[8-10]表明，脾胃濕熱證的脾胃組織存在大量炎癥浸潤(rùn)和不同程度的ROS 損傷，氧化應(yīng)激可能是引起脾胃功能病變的原因之一。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6～8 周齡，SPF 清潔級(jí)昆明小鼠60 只，體質(zhì)量18～20 g [遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（遼）2019-005]。

1.2 藥物及主要試劑 濕熱中阻方方藥組成：黃連10 g，姜厚樸15 g，制半夏10 g，淡豆豉10 g，焦梔子15 g，石菖蒲15 g，海螵蛸15 g，白及10 g，瓦楞子15 g，蘆根30 g，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；RIPA 裂解液（P0013B），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0012S），活性氧檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA,S0033M），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶試劑盒（LDH,A020）、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒（SOD,A001）、丙二醛測(cè)定試劑盒（MDA,A003）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒（CAT,A007），南京建成生物有限公司；白介素-6（IL-6,BMS603HS）、腫瘤壞死因子（TNF-α,BMS607HS），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；羊抗兔IgG [Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP,ZJ2020-R]、羊抗鼠IgG [Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP,ZJ2020-M]，Bioworld Technology 公司；極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光即用型底物（AR1191），武漢博士得生物工程有限公司；引物序列（COX2、iNOS、HO-1、β-Actin），生工生物工程（上海）股份有限公司；p-P38MAPK（4511）、p-NF-κB（3039）、p-IKBα（2859）、HO-1（43966）、GAPDH（5174），Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備 濕熱中阻方按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》的煎煮方法制備，藥液低溫濃縮至每1 mL 藥液中含生藥量1.2 g（根據(jù)《中藥藥理學(xué)》人鼠等效劑量換算），4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，區(qū)分雌雄，隨機(jī)分成6 組，分別為空白組，濕熱模型組，黃芩滑石湯組，濕熱中阻方低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半?？瞻捉M普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用200 g/L 蜂蜜水自由飲用，且隔日按小鼠體質(zhì)量灌服油脂10 g/kg，并與油脂隔日灌服10 mL/kg 白酒（紅星二鍋頭56°，北京紅星股份有限公司），共30 d。

1.3.3 動(dòng)物給藥 空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日10:00 定時(shí)投放食物和水，溫度25～28℃、濕度70%～80%。濕熱模型組：采用內(nèi)因濕熱法造模，在造模之前12 h開(kāi)始禁食不禁水。用高脂高糖飼料和蜂蜜水喂食。造模成功后，生理鹽水灌胃，每日1 次。濕熱中阻方低、中、高劑量組：造模成功后，予小鼠濕熱中阻方灌胃，每日1 次。陽(yáng)性藥組：造模成功后，黃芩滑石湯灌胃，每日1 次。共治療7 d。給藥期間自由進(jìn)食、飲水。每天觀察其一般情況，記錄精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)和大便情況。

1.3.4 標(biāo)本采集 取材前1 天開(kāi)始禁食不禁水，取材前禁食24 h。眼球取血1 mL，靜置1 h 后以3 000 r/min離心10 min，取上層血清置于EP 管中，于-20℃冰箱中保存待測(cè)。小鼠眼球取血后，脫頸處死，剪取胃竇，上述組織各取一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，另一半置于液氮中冷凍保存。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 一般情況觀察 觀察小鼠的生理狀況，如精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動(dòng)度、大便性狀等。每日測(cè)量小鼠的肛溫和體質(zhì)量，進(jìn)食量和進(jìn)水量。

1.4.2 iNOS mRNA、HO-1 mRNA、COX-2 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 1）取胃組織加入勻漿管中，加入4 ℃的RNA later；加入250 μL 三氯甲烷，在低溫環(huán)境下，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入異丙醇，-20℃放置15 min。在低溫環(huán)境下，繼續(xù)以12 000 r/min 離心10 min，收集管底白色沉淀物，即為總RNA。2）引物：引物序列見(jiàn)表1。3）熒光定量PCR：取7.5 μL 反應(yīng)體系于95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s 擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物作溶解曲線，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。

表1 PCR 引物序列表

1.4.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 取胃組織約0.5 g，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱定質(zhì)量，剪碎，冰浴勻漿，制成10%組織勻漿，4 000 r/min 低溫離心10 min，取上清液待測(cè)。取離心后的上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、IL-6、TNF-α、LDH、ROS 的含量。

1.4.4 Western blot 法分析胃竇p-P38MAPK、p-NF-κB、p-IKBα 表達(dá)水平 取胃竇組織，用預(yù)冷的PBS 洗滌2～3 次，裂解液裂解，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，收集上清液待測(cè)。將蛋白溶液按照4:1 的比例加入還原型蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min 變性，灌膠后加入SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。將轉(zhuǎn)印完的膜放入TBST 孵育槽中，室溫下封閉30 min，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再加二抗室溫孵育30 min，ECL 顯色，拍照。Alpha 軟件分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況 空白對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，大便正常。濕熱模型組小鼠出現(xiàn)嗜睡懶動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，皮毛無(wú)光澤，大便溏膩等表現(xiàn)。濕熱中阻方治療后，上述癥狀逐漸改善。

2.2 濕熱中阻方對(duì)LDH釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組小鼠LDH釋放量顯著升高（P＜0.001），LDH 是胃腸組織損傷的標(biāo)志物，說(shuō)明脾胃濕熱模型形成；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方中、高劑量組小鼠LDH 釋放量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；濕熱中阻方低劑量組LDH 釋放量明顯降低，但無(wú)顯著性差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組LDH 釋放量顯著降低（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能夠抑制脾胃濕熱引起LDH 的釋放，緩解胃腸組織損傷。見(jiàn)圖1。

圖1 濕熱中阻方對(duì)LDH 釋放的影響

2.3 濕熱中阻方對(duì)ROS 釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組ROS 生成顯著上升（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方低、中、高劑量組ROS生成受到顯著抑制（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），陽(yáng)性藥組ROS 生成量受到顯著抑制（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方可以降低脾胃濕熱刺激的胃細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，調(diào)節(jié)胃細(xì)胞氧化還原體系的平衡。見(jiàn)圖2。

圖2 濕熱中阻方對(duì)ROS 釋放的影響

2.4 濕熱中阻方對(duì)氧化應(yīng)激因子CAT、GSH-Px、MDA、SOD 釋放的影響

2.4.1 濕熱中阻方對(duì)CAT 釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組CAT 生成量明顯降低（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方中、高劑量組CAT 生成量明顯升高（P＜0.001）；濕熱中阻方低劑量組CAT 生成量明顯升高（P＜0.05）；陽(yáng)性藥組CAT 生成量顯著升高（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方可以升高體內(nèi)CAT 的生成量，增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力，抑制氧化應(yīng)激。見(jiàn)圖3。

圖3 濕熱中阻方對(duì)CAT 釋放的影響

2.4.2 濕熱中阻方對(duì)GSH-Px 釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組GSH-Px 生成量明顯降低（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組GSH-Px 生成量明顯升高（P＜0.01）；濕熱中阻方低、中劑量組GSH-Px 生成量明顯升高，但無(wú)顯著性差異；陽(yáng)性藥組GSH-Px 生成量明顯降低（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方可以升高體內(nèi)GSH-Px 的生成量，增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力，抑制氧化應(yīng)激。見(jiàn)圖4。

圖4 濕熱中阻方對(duì)GSH-Px 釋放的影響

2.4.3 濕熱中阻方對(duì)MDA 釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組MDA生成量明顯升高（P＜ 0.05），說(shuō)明氧化自由基產(chǎn)生增加，抗氧化能力減弱；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組MDA 生成量明顯降低（P＜0.05）；濕熱中阻方低、中劑量組MDA 生成量明顯降低，但無(wú)顯著性差異；陽(yáng)性藥組MDA 生成量受到顯著抑制（P＜0.05）。結(jié)果表明，濕熱中阻方可以抑制脾胃濕熱證引起的機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，抑制氧化應(yīng)激。見(jiàn)圖5。

圖5 濕熱中阻方對(duì)MDA 釋放的影響

2.4.4 濕熱中阻方對(duì)SOD 釋放的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組SOD 生成量明顯降低（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方中、高劑量組SOD 生成量明顯升高（P＜0.01，P＜0.001）；濕熱中阻方低劑量組SOD 生成量明顯降低，但無(wú)顯著性差異；陽(yáng)性藥組SOD 生成量受到顯著抑制（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方可以升高體內(nèi)SOD 的生成量，增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力，抑制氧化應(yīng)激。見(jiàn)圖6。

圖6 濕熱中阻方對(duì)SOD 釋放的影響

2.5 濕熱中阻方對(duì)炎癥因子IL-6、TNF-α 釋放的影響 與對(duì)照組比較，濕熱模型組IL-6、TNF-α 釋放量顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明脾胃濕熱證小鼠體內(nèi)炎癥因子含量升高；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組IL-6、TNF-α 釋放量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），濕熱中阻方中劑量組IL-6、TNF-α 釋放量顯著降低（P＜0.05），濕熱中阻方低劑量組IL-6、TNF-α釋放量明顯降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組IL-6、TNF-α釋放量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能降低炎癥因子的含量，減輕炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖7。

圖7 濕熱中阻方對(duì)IL-6、TNF-α 釋放的影響

2.6 濕熱中阻方對(duì)iNOS mRNA、HO-1 mRNA、COX-2 mRNA 表達(dá)的影響

2.6.1 濕熱中阻方對(duì)iNOS mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組iNOS mRNA 的表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組的表達(dá)量顯著降低（P＜0.001）；濕熱中阻方中劑量組的表達(dá)量顯著性降低（P＜0.01），濕熱中阻方低劑量組的表達(dá)量明顯降低，但無(wú)顯著性差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組的表達(dá)量顯著降低（P＜ 0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能抑制炎癥介質(zhì)iNOS mRNA 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖8。

圖8 iNOS mRNA 的表達(dá)量

2.6.2 濕熱中阻方對(duì)HO-1 mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組HO-1 mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜ 0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；濕熱中阻方低、中劑量組表達(dá)量明顯降低，但無(wú)顯著差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能抑制炎癥介質(zhì)HO-1 mRNA的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖9。

圖9 HO-1 mRNA 的表達(dá)量

2.6.3 濕熱中阻方對(duì)COX-2 mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組COX2 mRNA 的表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組的表達(dá)量顯著性降低（P＜0.01），濕熱中阻方中劑量組的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），濕熱中阻方低劑量組的表達(dá)量明顯降低，但無(wú)顯著性差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組的表達(dá)量顯著降低（P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能抑制炎癥介質(zhì)COX2 mRNA 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖10。

圖10 COX2 mRNA 的表達(dá)量

2.7 濕熱中阻方對(duì)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，濕熱模型組小鼠P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方高劑量組蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01，P＜ 0.001，P＜0.001）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方中劑量組P-p38MAPK、P-IKBα 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜ 0.05，P＜0.001），對(duì)P-NF-κB 的蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（本數(shù)據(jù)有明顯錯(cuò)誤，故排除）；與濕熱模型組比較，濕熱中阻方中、高劑量組P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.001），P-p38MAPK 蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著差異；與濕熱模型組比較，陽(yáng)性藥組蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。結(jié)果表明，濕熱中阻方能抑制p38MAPK、NF-κB、IKBα 信號(hào)通路，降低活化的P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 含量。見(jiàn)圖11，表2。

圖11 濕熱中阻方對(duì)P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα蛋白表達(dá)的影響

表2 濕熱中阻方對(duì)P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

脾胃濕熱證的臨床表現(xiàn)主要是消化系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)胃組織并釋放炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)刺激ROS 釋放，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。脾胃濕熱證產(chǎn)生的ROS 可進(jìn)入血液循環(huán)而使外周血中ROS 含量增加[11]，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破，ROS 表達(dá)過(guò)量[12]，進(jìn)而刺激機(jī)體釋放大量促炎因子，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷[13]。

本研究結(jié)果表明，脾胃濕熱模型組的ROS、LDH含量增高，CAT、SOD、GSH-Px 含量降低，說(shuō)明脾胃濕熱證激活小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加細(xì)胞損傷。脾胃濕熱模型組的炎癥調(diào)控因子P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著升高，其進(jìn)入細(xì)胞核激活多種促炎轉(zhuǎn)錄因子如HO-1 mRNA、COX2 mRNA、iNOS mRNA 表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化，使IL-6、TNF-α 表達(dá)量升高，加劇胃組織損傷。脾胃濕熱證形成后，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)胃組織并釋放炎癥介質(zhì)，炎癥因子的表達(dá)破壞了氧化-抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，氧化應(yīng)激能促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[14-15]，炎癥細(xì)胞活化后產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致炎癥性病變后的氧化應(yīng)激水平升高。氧化因子MDA、LDH 增多，抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD減少，生成過(guò)多的ROS，ROS 的增加被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要原因。且ROS 增多能夠繼續(xù)激活氧化通路，使氧化損傷不斷擴(kuò)大。

中焦脾胃為樞機(jī)之地，濕熱之邪阻滯中焦，則中焦氣機(jī)不通，治法當(dāng)恢復(fù)脾胃生理功能。濕熱中阻方以辛開(kāi)苦降法為組方原則，辛以化濁，苦以降濁，脾升胃降，則功能自復(fù)。脾胃濕熱證小鼠經(jīng)過(guò)濕熱中阻方治療后，氧化因子MDA、ROS、LDH 的含量降低，抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD含量升高，P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表達(dá)量降低，HO-1 mRNA、COX2 mRNA、iNOS mRNA 的含量降低，炎癥因子IL-6、TNF-α 含量降低，說(shuō)明濕熱中阻方可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，脾胃濕熱證與炎癥之間關(guān)系密切，濕熱中阻方對(duì)脾胃濕熱證小鼠具有一定治療作用。濕熱中阻方能夠通過(guò)清除LDH、ROS，降低炎癥因子MDA 的表達(dá)，增加抗氧化因子SOD、CAT、GSH-Px的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平來(lái)改善脾胃濕熱證小鼠炎癥反應(yīng)。