氯喹通過阻斷腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3自噬性降解抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活化

呂昌偉 和晶 張乾 郗海濤 強(qiáng)毅 張靜濤

西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院骨科（西安710018）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，最終可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)損傷甚至殘疾［1］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理改變以慢性滑膜炎和骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損害為特征，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前并無完全有效的根治方法［2］。近來的研究顯示，纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast?like synoviocyte，F(xiàn)LS）的異?；罨陬愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其可通過產(chǎn)生炎性因子引起滑膜炎癥和病理損傷［3］?；罨腇LS表現(xiàn)出過度增殖，并產(chǎn)生多種炎癥因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），如TNF?α、IL?1β、IL?6、CXCL10、MMP?2和MMP?9，造成關(guān)節(jié)的慢性炎癥和持續(xù)性破壞［4］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）是屬于腫瘤壞死因子受體作用因子超家族成員，是細(xì)胞內(nèi)一種重要的負(fù)性調(diào)控蛋白，包括抑制CREB、NF?κB和STAT3信號(hào)［5］。NF?κB信號(hào)的異常激活可引起持續(xù)高強(qiáng)度炎癥，導(dǎo)致IL?6、MMP?2、MMP?9、CXCL10等多種炎性因子水平升高，誘發(fā)多種自身免疫性疾病［6］，并在FLS的激活中發(fā)揮了重要作用［4］。

目前，氯喹用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療取得了較好的療效，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究探討氯喹對FLS異常激活的抑制作用，并通過探討氯喹對TRAF3蛋白水平的影響，以及對TRAF3自噬性降解的影響，以期闡明氯喹抑制FLS活化的分子機(jī)制，為氯喹治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞（MH7A）于重慶巴而思生物科技有限公司購買，采用RPMI?1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）補(bǔ)充10%胎牛血清（AusGeneX，澳大利亞）和1%青鏈霉素（碧云天，中國）進(jìn)行培養(yǎng)。采用TNF?α預(yù)處理建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活化模型，即除對照組外，所有MH7A細(xì)胞接受5 ng/mL的重組人THF?α（BBI，中國）預(yù)刺激24 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，分別采用20 μmol/L氯喹（MCE，美國）、10 μmol/L雷帕霉素（Rapa，MCE）和10 μmol/L蛋白酶體抑制劑MG?132（MCE）處理細(xì)胞24 h。siRNA干擾TRAF3表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行上述藥物處理。

1.2 si?RNA轉(zhuǎn)染使用不含青霉素/鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)基接種細(xì)胞至6孔板，培養(yǎng)12 h。將TRAF3 siRNA（Santa Cruz，美國）溶于optiMEM培養(yǎng)基（Gibco），將相應(yīng)體積lipofectamin 2000（In?vitrogen，美國）溶于optiMEM培養(yǎng)基中，將配制好的siRNA溶液和lipofectamin 2000溶液等體積混合，室溫穩(wěn)定20 min，加入4倍體積新鮮optiMEM培養(yǎng)基混勻。吸出細(xì)胞舊培養(yǎng)基，每孔加入1 mL配制好的siRNA轉(zhuǎn)染液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 h，換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測細(xì)胞處理結(jié)束后，采用CCK?8試劑（碧云天）檢測細(xì)胞增殖。吸出舊培養(yǎng)接，使用新培養(yǎng)基配制CCK?8溶液，加入各處理孔，37℃培養(yǎng)箱放置1 h，使用酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）在450 nm測定吸光度。

1.4 Real?time PCR細(xì)胞處理結(jié)束后，RNAiso Plus（TaKaRa，中國）按照使用說明書提取總RNA，采用PrimeScriptRT Master Mix試劑盒（TaKaRa）按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用TB Green Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa）按照使用說明，進(jìn)行real?time PCR檢測。引物序列如下：GAPDH：forward 5′?AGGTCGGTGTGAACGGATT?3′，reverse 5′?AAT CTCCACTTTGCCACTGC?3′；TRAF3：forward 5′?AC?ATCCGCCTAGCCGACATGG?3′，reverse 5′?CTGCT?TCCGCCGCTTGTAGTC?3′。

1.5 ELISA檢測細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎因子含量。IL?6和CXCL10 ELISA檢測試劑盒訂購于博士德生物，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

1.6 Western blot細(xì)胞處理結(jié)束后，RIPA裂解液（碧云天，中國）提取蛋白，BCA蛋白測定試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度，加入4×Laemmli上樣緩沖液（Bio?Rad，美國），97.5℃變性10 min。SDS?PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)模后5%脫脂奶粉室溫封閉，洗膜后分別孵TRAF3一抗（1∶1 000，CST，美國）、LC3一抗（1∶1 000，CST）、MMP?2一抗（1∶1 000，Protein?tech）、MMP?9一抗（1∶1 000，Proteintech），β?actin一抗（1∶2 000，CST），4℃過夜。洗膜后羊抗鼠和羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio?Rad）中曝光檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果數(shù)據(jù)采用（）表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析并跟以Fisher′s post hoc檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯喹抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活化相比對照組，TNF?α刺激導(dǎo)致了MH7A細(xì)胞IL?6和CX?CL10分泌顯著增加（圖1B、C），并且引起了MH7A細(xì)胞侵襲蛋白MMP?2和MMP?9表達(dá)增加（圖1D），表明TNF?α預(yù)刺激有效引起了MH7A細(xì)胞活化。與TNF組相比，氯喹處理顯著抑制了MH7A細(xì)胞增殖（圖1A），降低了TNF?α引起的IL?6和CXCL10分泌（圖1B、C），以及MMP?2和MMP?9表達(dá)（圖1D）。這些結(jié)果表明，氯喹可顯著抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活化。

圖1 氯喹抑制MH7A纖維樣滑膜細(xì)胞活化Fig.1 Chloroquine inhibits the activation of MH7A fibroblast?like synoviocytes

2.2 氯喹引起MH7A細(xì)胞TRAF3蛋白含量升高TNF?α刺激和氯喹處理均未引起MH7A細(xì)胞TRAF3 mRNA表達(dá)的變化（圖2A），表明氯喹并不引起TRAF3基因表達(dá)水平的改變。然而，Western blot結(jié)果顯示。氯喹處理可導(dǎo)致MH7A細(xì)胞內(nèi)TRAF3蛋白含量顯著升高（圖2B）。這些結(jié)果提示，氯喹所致的TRAF3蛋白水平升高，并不是源于其基因表達(dá)的上調(diào)，而可能源于氯喹抑制了TRAF3的降解。

圖2 氯喹引起MH7A滑膜細(xì)胞TRAF3蛋白表達(dá)升高Fig.2 Chloroquine increased the expression of TRAF3 protein in MH7A synoviocytes

2.3 TRAF3介導(dǎo)了氯喹對MH7A細(xì)胞活化的抑制通過TRAF3 siRNA下調(diào)MH7A細(xì)胞TRAF3蛋白表達(dá)，探討TRAF3在氯喹抑制MH7A細(xì)胞活化中的作用。結(jié)果顯示，si?TRAF3顯著降低了MH7A細(xì)胞內(nèi)TRAF3蛋白水平（圖3A）。由結(jié)果可見，si?TRAF3可顯著拮抗氯喹對MH7A細(xì)胞活化的抑制作用，阻斷了氯喹對IL?6和CXCL10的分泌抑制（圖3B、C），并解除了氯喹對MMP?2和MMP?9蛋白表達(dá)的抑制（圖3D）。

2.4 氯喹抑制了TRAF3蛋白的自噬性降解進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)可見，氯喹可引起MH7A細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值降低（圖4A），表明氯喹抑制了MH7A細(xì)胞自噬。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（RA）則顯著增加了細(xì)胞自噬水平（圖4A）。并且，雷帕霉素拮抗了氯喹的效應(yīng)，導(dǎo)致MH7A細(xì)胞TRAF3蛋白水平明顯降低（圖4B）。此外，氯喹所致的TRAF3蛋白含量升高未被蛋白酶體抑制劑MG132進(jìn)一步增強(qiáng)（圖4B）。這些結(jié)果表明，氯喹可能主要通過抑制細(xì)胞自噬，阻斷TRAF3的自噬性降解，導(dǎo)致了MH7A細(xì)胞TRAF3蛋白含量升高。

圖3 TRAF3介導(dǎo)了氯喹對MH7A細(xì)胞的活化抑制Fig.3 TRAF3 mediated the inhibition of the activation of MH7A cells by chloroquine

圖4 氯喹抑制MH7A細(xì)胞自噬和TRAF3蛋白自噬性降解Fig.4 Chloroquine inhibits autophagy of MH7A cells and autophagic degradation of TRAF3 protein

2.5 誘導(dǎo)自噬可拮抗氯喹對MH7A細(xì)胞的活化抑制采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和氯喹共處理MH7A細(xì)胞?？梢?，與氯喹處理組相比，雷帕霉素可對抗氯喹作用，顯著促進(jìn)MH7A細(xì)胞IL?6和CX?CL10分泌增加（圖5A，B），并引起MH7A細(xì)胞MMP?2和MMP?9蛋白水平升高（圖5C）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了氯喹通過阻止TRAF3自噬性降解抑制MH7A細(xì)胞活化。

圖5 誘導(dǎo)自噬可拮抗氯喹對MH7A細(xì)胞的活化抑制Fig.5 Induction of autophagy antagonized the inhibition of MH7A cell activation by chloroquine

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制至今尚未明確，使得其缺乏確切有效的根治方法。近來，纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的異?；罨陬愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理中獲得了重視。FLS在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的多種病理進(jìn)程中均發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如滑膜炎癥，血管翳生長，以及最終的軟骨和骨破壞［7］。FLS在炎性滑膜的異常增生是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的典型特征［7］。這種細(xì)胞的增多源于FLS的大量增殖和凋亡減少［8］。另外，F(xiàn)LS被激活后可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，使細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲特性，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織破壞［7，9］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜炎癥中，F(xiàn)LS激活同樣發(fā)揮了重要作用?；罨腇LS可分泌多種促炎因子，如IL?6、IL?1β和CXCL10等［10-11］，進(jìn)而影響其他細(xì)胞和自身免疫反應(yīng)性。本研究中，采用TNF?α預(yù)刺激建立FLS活化模型。結(jié)果可見，TNF?α預(yù)刺激可引起FLS細(xì)胞增殖，導(dǎo)致MMP?2和MMP?9蛋白表達(dá)升高，并引起IL?6和CXCL10分泌的增加，表明TNF?α刺激有效引起了FLS細(xì)胞的活化。

氯喹和羥氯喹已被應(yīng)用于治療輕中度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療時(shí)的聯(lián)合用藥［12］。雖然氯喹對免疫?炎癥反應(yīng)的抑制作用已被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，包括抑制免疫細(xì)胞增殖和活性，抑制炎癥因子分泌，但對其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制了解仍非常有限［13］。在本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，氯喹處理可有效抑制FLS細(xì)胞的增殖、炎癥因子分泌以及侵襲標(biāo)志物MMP?2和MMP?9的表達(dá)，表明氯喹可有效抑制FLS的異常活化。這些結(jié)果表明，抑制FLS異常激活可能是氯喹治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制。同時(shí)，氯喹是一種高效的親溶酶體抑制劑，可特異的抑制細(xì)胞溶酶體自噬途徑［14］。自噬從多個(gè)方面參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程，包括FLS的存活、侵襲和凋亡抵抗［15］。最新的研究顯示，抑制自噬可以提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果［16］。因此，氯喹可能通過抑制溶酶體自噬而發(fā)揮上述FLS活化抑制作用。本研究證實(shí)，氯喹處理可顯著抑制FLS細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值的降低。

TRAF3是一種重要的炎癥?免疫負(fù)性調(diào)控因子，其通過抑制多種信號(hào)通路而抑制免疫細(xì)胞活化，如NF?κB、IL?6R、CD40和CREB信號(hào)通路［5，17］。已有研究顯示，激活TRAF3信號(hào)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并可減輕動(dòng)物炎癥反應(yīng)［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹能夠增加MH7A細(xì)胞內(nèi)TRAF3的蛋白含量，而干擾TRAF3表達(dá)阻斷了氯喹對MH7A細(xì)胞活化的抑制，表明氯喹通過TRAF3增加抑制FLS活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，并且這種增加不是由于基因表達(dá)的增加。因此，氯喹可能通過抑制溶酶體自噬降解而實(shí)現(xiàn)TRAF3的蛋白含量升高。這一猜測被自噬誘導(dǎo)劑和蛋白酶體抑制劑實(shí)驗(yàn)證實(shí)。這些結(jié)果表明，氯喹通過阻斷TRAF3溶酶體自噬降解，抑制FLS細(xì)胞活化。

NF?κB信號(hào)激活和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜病變程度程正相關(guān)，抑制NF?κB表達(dá)和信號(hào)激活，可顯著抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展［20］，而增加NF?κB表達(dá)可加速類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的侵襲進(jìn)展［21］。NF?κB是TRAF3的主要負(fù)性調(diào)控信號(hào)通路，因此TRAF3對纖維樣滑膜細(xì)胞活化的抑制可能藉由抑制NF?κB信號(hào)實(shí)現(xiàn)。

本研究從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎纖維樣滑膜細(xì)胞異?；罨嵌龋U明了氯喹治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制。氯喹長時(shí)間大劑量的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療應(yīng)用可誘發(fā)不良反應(yīng)，尤其是眼毒性［22］。因此，闡明氯喹治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制，有助于指導(dǎo)臨床聯(lián)合用藥，降低藥物劑量，有利于降低不良反應(yīng)的發(fā)生。