半邊紅李炭疽病病害調(diào)查及病原菌鑒定

王 群，畢云青，何成興，郭志祥，鐘德衛(wèi)，李君洪，陳乾昭，游繼華，黃正會(huì)，李進(jìn)斌

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2云南省昭通市綏江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)技推廣中心，云南綏江 657700；3綏江縣漁業(yè)技術(shù)服務(wù)站，云南綏江 657700）

0 引言

李子(Prunussalicina)是薔薇科李屬植物，其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，且酸甜可口，從而深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。半邊紅李(P.salicina‘Banbianhong’)在綏江已有70余年種植歷史，種植面積已超過(guò)5400 hm2，是綏江縣的主要支柱產(chǎn)業(yè)。由于其優(yōu)良的品質(zhì)及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)被引種到昭通多個(gè)縣區(qū)以及四川、重慶、貴州、江西等省份。但隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，綏江半邊紅李病害每年都有發(fā)生。主要的病害有炭疽病、紅點(diǎn)病、褐腐病和穿孔病等，其中炭疽病尤為嚴(yán)重。炭疽病病菌主要為害葉片、嫩芽及果實(shí)，會(huì)導(dǎo)致葉片腐爛、枯萎以及果實(shí)掉落，嚴(yán)重的時(shí)候影響李子的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。

炭疽病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum真菌，種類十分的復(fù)雜繁多，在全球范圍均有分布，寄主十分廣泛，涉及糧食、經(jīng)濟(jì)、果樹、花卉、蔬菜等重要作物[2-3]，對(duì)作物生產(chǎn)安全造成重要影響。自19世紀(jì)30年代Corda建立炭疽菌屬以來(lái)[4]，其分類一直較混亂。炭疽菌屬發(fā)展的初期，分類依據(jù)以寄主范圍為主，750個(gè)新種被描述[4]，導(dǎo)致了許多異名同物的出現(xiàn)。20世紀(jì)50年代，Arx J.von對(duì)所報(bào)道的絕大多數(shù)真菌標(biāo)本作了細(xì)微的觀察與比較后，主要依據(jù)寄主上病原菌孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞等顯微形態(tài)特征，并結(jié)合純培養(yǎng)特征等將750余種合并為11個(gè)種[5]。由于Arx分類系統(tǒng)中種的范圍太大，導(dǎo)致了同名異物的出現(xiàn)，實(shí)際運(yùn)用非常不便。20世紀(jì)八、九十年代，Sutton在Arx系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子和附著孢形態(tài)特征、大小為主，結(jié)合純培養(yǎng)物特征和寄主范圍，把Arx系統(tǒng)中的11個(gè)種擴(kuò)展到39個(gè)種，其中包含了部分復(fù)合種，如C.gloeosporioides、C.acutatum和C.dematium[3,6]。Sutton的分類系統(tǒng)普遍得到了真菌研究者的認(rèn)可，但該分類系統(tǒng)中許多形態(tài)相似的種仍然難以區(qū)分。因此，炭疽菌的分類鑒定一直是菌物學(xué)家的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)炭疽菌屬的分類鑒定方法產(chǎn)生了重要的影響，屬下分類單元也不斷增加。目前該屬的分類主要包括膠孢炭疽復(fù)合群C.gloeosporioidesspecies complex、博寧炭疽復(fù)合群C.boninensespecies complex、尖孢炭疽復(fù)合群C.acutatumspecies complex、暹羅炭疽復(fù)合群C.siamensespecies complex、長(zhǎng)直孢炭疽復(fù)合群C.gigasporumspecies complex、禾生炭疽復(fù)合群C.graminicolaspecies complex、圓孢炭疽復(fù)合群C.orbicularespecies complex、平頭炭疽復(fù)合群C.truncatumspecies complex、白蠟樹炭疽復(fù)合群C.spaethianumspecies complex、毀滅炭疽復(fù)合群C.destructivumspecies complex、束狀炭疽復(fù)合群C.dematiumspecies complex和尾狀炭疽復(fù)合群C.caudatumspecies complex等12個(gè)復(fù)合群和部分獨(dú)立種[7-16]。真菌rDNA由18S、5.8S、28S三個(gè)亞基組成，三亞基之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)是核糖體DNA(rDNA)上的非編碼區(qū)。18S、5.8S及28S rDNA序列進(jìn)化緩慢且相對(duì)保守，但3個(gè)基因序列之間的ITS序列則進(jìn)化相當(dāng)迅速，因而核糖體rDNA序列廣泛用于真菌各級(jí)水平的系統(tǒng)學(xué)研究[17-18]。ITS區(qū)具有鑒定范圍最廣、成功率最高及種內(nèi)、種間變異具有最清晰明確的條形碼間隔等特點(diǎn)，可作為通用的真菌條形碼標(biāo)記[19]。ITS序列分析現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于炭疽菌、疫霉菌、銹菌等植物病原真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究。因此，炭疽菌ITS序列對(duì)種及種以下的劃分具有一定的意義[20-21]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)李樹炭疽病病原菌鑒定研究較少。根據(jù)病原菌形態(tài)、培養(yǎng)特性和致病性，布朗李(P.americana)炭疽病菌有性世代鑒定為Glomerella cingulata，無(wú)性世代為C.gloeosporioides[22]。利用形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)，韓國(guó)研究者從日本李(P.salicina)果實(shí)上分離鑒定了4種炭疽菌，分別屬于膠孢炭疽復(fù)合群中的C.gloeosporioidessensu stricto(s.s.)、暹羅炭疽復(fù)合群中的C.siamense、尖孢炭疽復(fù)合群中的C.nymphaeae和C.foriniae[23]，其中C.siamense和C.foriniae首次在李炭疽病中報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)李樹(P.salicina)產(chǎn)區(qū)的炭疽菌種類還未見報(bào)道。本研究對(duì)綏江縣半邊紅李炭疽病的為害進(jìn)行了初步調(diào)查，并對(duì)其病原菌進(jìn)行了采集、分離，結(jié)合致病性測(cè)定、純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)特征及核糖體ITS序列對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，為李樹炭疽病的診斷及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

CTAB購(gòu)自Sigma公司；ITS引物合成自上海生工公司；2×Taq PCR Master Mix試劑、Marker DL2000，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA回收試劑盒，購(gòu)自北京百泰克公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。病害調(diào)查于2018年7月云南省昭通市綏江縣半邊紅李主要種植區(qū)進(jìn)行，病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定及ITS序列分析實(shí)驗(yàn)均于2018年8月—2019年12月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所作物病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要儀器

Sorvall Legend Micro 21R離心機(jī)，德國(guó)Themo Scientific公司生產(chǎn)；C1000 Touch DNA擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；BIO-RAD PowerPacTM Basic電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；DYCP-31DN電泳槽，北京六一儀器廠；ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；MGC-400B光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Nikon 80i顯微鏡，日本Nikon公司生產(chǎn)。

1.3 炭疽病病害調(diào)查及標(biāo)樣的采集

2018年7月，采用5點(diǎn)取樣法分別對(duì)云南省昭通市綏江縣半邊紅李2個(gè)主要種植區(qū)會(huì)儀鎮(zhèn)及新灘鎮(zhèn)各3個(gè)果園進(jìn)行炭疽病的病害調(diào)查。每點(diǎn)隨機(jī)選取5株，每株從東南西北4個(gè)方向每個(gè)方向隨機(jī)采集10片葉片調(diào)查病害發(fā)病級(jí)別。根據(jù)病斑面積占葉面積的比例，李子炭疽病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照辣椒炭疽病的0～9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[24]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)：無(wú)病斑；高抗

1級(jí)：1%～2%的葉片病斑侵染面積或有一個(gè)水浸狀病斑；抗病。

3級(jí)：壞死性病斑葉面積＞2%～5%，可能出現(xiàn)分生孢子盤，或5%的葉片出現(xiàn)水浸狀病斑；中抗。

5級(jí)：壞死性病斑葉面積＞5%～15%，有分生孢子盤，或25%的葉片出現(xiàn)水浸狀病斑；中感。

7級(jí)：壞死性病斑葉面積＞15%～25%，有分生孢子盤；感病。

9級(jí)：壞死性病斑葉面積＞25%，有大量分生孢子盤；高感。

發(fā)病率和病情指數(shù)分別用公式(1)和公式(2)計(jì)算[25-26]。

采集炭疽病癥狀典型的發(fā)病葉片為標(biāo)樣，病害標(biāo)樣在病菌分離前4℃儲(chǔ)存。

1.4 病原菌組織、單孢菌株的分離及分生孢子形態(tài)觀察

病原菌組織分離參照楊樹炭疽菌的分離方法[27]。方法如下：健康組織和病變組織交界面切取3個(gè)5×5 mm的樣品，用70%乙醇浸泡1 min，然后用1%次氯酸鈉浸泡3～4 min，用無(wú)菌水洗滌3次。然后將葉段置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基表面，在25℃下培養(yǎng)。1～2天后將葉段發(fā)育的真菌菌絲生長(zhǎng)邊緣轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上以供后續(xù)研究使用。

單胞分離參照方中達(dá)的方法分離[28]。蘸取分生孢子團(tuán)至無(wú)菌水中，稀釋至105孢子/mL，取10 μL上述孢子液均勻涂布在WA（1%水瓊脂）平板上，25℃培養(yǎng)12 h后在光學(xué)顯微鏡下挑取萌發(fā)的單孢子接種于PDA平板上，5天后觀察菌株菌落及分生孢子形態(tài)。各菌株隨機(jī)選取10個(gè)孢子利用ImageJ軟件測(cè)量孢子大小，并計(jì)算長(zhǎng)度及寬度的比值，采用Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

1.5 半邊紅李炭疽病病原菌致病性鑒定

病原菌致病性鑒定根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行。采集半邊紅李樹健康葉片，自來(lái)水清洗葉片表面，再用無(wú)菌水沖洗3～4次；將分離的菌株活化后，接種到PDA平板上，25℃培養(yǎng)3天，用直徑為5 mm的無(wú)菌打孔器沿菌落邊緣打取菌絲塊，接種到葉片上。對(duì)照為直徑5 mm的清水培養(yǎng)基塊。由于炭疽病菌具有潛伏侵染特性且潛伏期較長(zhǎng)，采用刺傷法（接種針刺破葉片表皮，但不刺穿葉片）接種，保持濕度90%以上，溫度23℃。接種4天后，移去菌株塊，7天后記錄發(fā)病情況。并鏡檢病原菌形態(tài)，與分離菌比較。

1.6 半邊紅李炭疽病菌的分子鑒定

1.6.1 菌絲的收集及基因組DNA的提取 菌絲培養(yǎng)：將培養(yǎng)3天的菌株沿菌落邊緣挑取5個(gè)菌絲塊，移入裝有80 mL PDB（配方同PDA培養(yǎng)基，但不含瓊脂）的三角瓶中，在100 r/min的搖床上25℃培養(yǎng)5天，4層紗布過(guò)濾收集病原菌的菌絲，-80℃保存。用CTAB法提取基因組DNA[29]。

1.6.2 病原菌rDNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 利用真菌ITS通用引物ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')和 ITS4(5'TCCTCC GCTTATTGATATGC 3')[30]，以病原菌基因組DNA為模板擴(kuò)增包含ITS1、5.8S rDNA、ITS2、部分18S rDNA和28S rDNA的DNA片段。PCR反應(yīng)體系為30 μL，包含Mix 15 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL，于 DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。利用DNA回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，方法參見試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

1.6.3 病原菌ITS片段的序列分析 用LasergenV7.1.0中的seqman軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接，并手工校正，兩端進(jìn)行修剪。將拼接的序列導(dǎo)入Genbank中進(jìn)行Blast分析，下載同源性高的序列進(jìn)行比對(duì)分析。序列比對(duì)在CLUSTAL W 1.81中進(jìn)行[31]；系統(tǒng)進(jìn)化分析利用MEGA7.0[32-33]，采用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)樹?；赥amura-Nei model的核酸替代模型，各位點(diǎn)間的進(jìn)化速率為一致，缺失或空位記為完全缺失。

Bootstrap法進(jìn)行系統(tǒng)樹檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病病害調(diào)查結(jié)果

炭疽病危害葉片的癥狀主要有兩類：一類沿葉緣開始發(fā)病，病斑由小至大，典型病斑成輪紋狀擴(kuò)展；另一類病斑多在葉片尖端開始發(fā)病，葉片邊緣發(fā)病較少，病斑較大，典型的輪紋狀病斑，病斑邊緣紫褐色。炭疽病病害調(diào)查結(jié)果見表1。由表1可以看出，會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村3個(gè)果園炭疽病的發(fā)病率為20%，病情指數(shù)為20.4；新灘鰱魚村3個(gè)果園炭疽病的發(fā)病率達(dá)到50%，病情指數(shù)為78.5。同時(shí)，從海拔梯度來(lái)看，500～700 m海拔危害程度最嚴(yán)重，其次是700～900 m海拔，380～500 m海拔發(fā)病程度最輕，表明會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村和新灘鎮(zhèn)鰱魚村的半邊紅李果園有不同程度的炭疽病危害，其中新灘鎮(zhèn)鰱魚村比會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村的危害程度嚴(yán)重，不同海拔果園炭疽病的危害程度也不相同。

表1 基于0～9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的綏江6個(gè)半邊紅李果園炭疽病發(fā)病率及病情指數(shù)

2.2 半邊紅李炭疽病菌形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)綏江縣會(huì)儀黃坪鎮(zhèn)黃坪村、新灘鎮(zhèn)鰱魚村半邊紅李果園采集的癥狀典型的炭疽病葉片進(jìn)行了單孢分離，共獲得15株分離株。根據(jù)分生孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)4種類型的分生孢子（圖1），其代表菌株分別為18-8-D1、18-4-C2、18-8-C1及18-5-B1。其中18-5-B1菌株的分生孢子梭形，直孢，末端鈍；18-8-C1菌株的分生孢子為圓柱狀，直孢；18-8-D1菌株的分生孢子為彎孢型，端鈍，有3-5隔；18-4-C2菌株的分生孢子為紡錘型，兩端漸尖，2隔，具1-3根附屬絲。平板菌落形態(tài)沒(méi)有明顯的差異，菌落白色，菌絲生長(zhǎng)茂密厚實(shí)，菌落背面中心顏色較深，為淡黃色或黑綠色（圖1）。4種分生孢子大小測(cè)量結(jié)果見表2。表2可以看出，分生孢子長(zhǎng)度以菌株18-8-D1最長(zhǎng)，達(dá)21.94±2.25 μm，其次是菌株18-4-C2；除18-5-B1與18-8-C1長(zhǎng)度差異不明顯外，其余菌株間長(zhǎng)度差異均達(dá)極顯著。分生孢子寬度以菌株18-4-C2最寬，達(dá)4.72±0.64 μm，其次是18-5-B1(4.35±0.53)，18-8-D1最窄(2.62±0.52)；除18-4-C2與18-5-B1、18-5-B1與18-8-C1之間寬度差異不顯著外，其余菌株間均達(dá)極顯著；分生孢子長(zhǎng)寬比以菌株18-8-D1為最大，其中18-8-D1與其他菌株間差異極顯著，其他菌株間差異均不顯著。

圖1 半邊紅李炭疽病菌株18-5-B1、18-8-C1、18-8-D1和18-4-C2菌落及分生孢子形態(tài)

表2 云南綏江半邊紅李炭疽病分離菌株分生孢子大小

2.3 李炭疽菌的Korho驗(yàn)證

根據(jù)柯赫氏法則，將分離到的病原菌接種在健康的李樹葉片進(jìn)行了離體鑒定，部分結(jié)果見圖2?；亟拥蔫b定結(jié)果表明前述分離到的病原菌均產(chǎn)生了特征明顯的炭疽病病斑，并從病斑上分離獲得與接種相同的病原菌。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明本研究成功分離到了李炭疽病的致病菌，且分離到的菌株均致病。

圖2 半邊紅李炭疽病分離菌株18-8-C1、18-5-B1接種離體葉片9天后的發(fā)病癥狀

2.4 李炭疽病病原菌ITS序列分析

利用真菌通用引物ITS1和ITS4分別擴(kuò)增了15個(gè)菌株的rDNA ITS片段，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖3。除去1個(gè)菌株沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物外，其余14個(gè)菌株均成功擴(kuò)增出了ITS區(qū)段。

圖3 部分半邊紅李炭疽病菌分離株ITS引物PCR擴(kuò)增電泳圖

對(duì)4種分生孢子類型的代表菌株18-5-B1、18-8-C1、18-8-D1和18-4-C2的ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，在Genbank中對(duì)其序列進(jìn)行了同源性比較(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，發(fā)現(xiàn)這4條序列與炭疽菌屬ITS序列同源性較高。鑒于Genbank中炭疽菌ITS序列數(shù)量巨大，物種信息及ITS序列質(zhì)量難以獲得保障，為了進(jìn)一步鑒定半邊紅李炭疽菌，選擇經(jīng)過(guò)模式標(biāo)本和序列質(zhì)量、長(zhǎng)度驗(yàn)證后重新注釋和格式化后的參考序列（refseq，Genbank中序列前綴為NR-）為主，已發(fā)表論文中引用的Genbank序列為輔，下載了12個(gè)炭疽菌復(fù)合群內(nèi)的110種、2亞種共139條ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，Genbank序列號(hào)見附錄1。下載序列中，膠孢炭疽復(fù)合群包括23種2亞種27條序列，博寧炭疽復(fù)合群15種15條序列，尖孢炭疽復(fù)合群32種37條序列，暹羅炭疽復(fù)合群6種11條序列，長(zhǎng)直孢炭疽復(fù)合群7個(gè)種7條序列，禾生炭疽復(fù)合群1個(gè)種1條序列，圓孢炭疽復(fù)合群7個(gè)種7條序列，平頭炭疽復(fù)合群1種1條序列，白蠟樹炭疽復(fù)合群1種1條序列，毀滅炭疽復(fù)合群11種11條序列，束狀炭疽復(fù)合群1種1條序列，尾狀炭疽復(fù)合群5種20條序列。構(gòu)建的ML系統(tǒng)樹為無(wú)根樹（圖4），SBL=0.4998，似然比值(log likelihood=-1744.35)，模型為 TN93，Ts/Tv=2.1680。由圖4可以看出，半邊紅李分離到的4個(gè)菌株（18-8-D1、18-4-C2、18-8-C1和18-5-B1）與膠孢炭疽復(fù)合群、暹羅炭疽復(fù)合群以及一個(gè)長(zhǎng)直孢炭疽聚在一個(gè)分支中，暗示這些菌株與膠孢炭疽復(fù)合群和暹羅炭疽復(fù)合群親緣關(guān)系較近；其余復(fù)合群都各自聚為一支，暗示ITS序列可以作為一個(gè)很好的分子標(biāo)記用以區(qū)分炭疽復(fù)合群之間的關(guān)系。菌株18-8-C1與NR120142、18-8-D1與 NR144783、18-4-C2與NR120133及菌株18-5-B1與GQ485601關(guān)系較近（圖4），但支持率不高。由附錄1，可知NR120142、NR144783及NR120133分別為膠孢炭疽復(fù)合群中的C.clidemiae、C.fructicola及C.aeschynomenes的ITS序列，GQ485601為暹羅炭疽復(fù)合群中的C.hymenocallidis的ITS序列。分別將本研究中分離到的菌株分生孢子形態(tài)大小及菌落形態(tài)與C.clidemiae[15]、C.fructicola[15,34]、C.aeschynomenes[15]、C.hymenocallidis[35]的相比較，發(fā)現(xiàn)均存在一些差異。因此，本項(xiàng)研究?jī)H可以初步鑒定綏江半邊紅李炭疽病為膠孢炭疽復(fù)合群和暹羅炭疽復(fù)合群中的炭疽菌引起，具體種類歸屬有待進(jìn)一步研究。

圖4 基于4個(gè)半邊紅李炭疽病菌及Genbank中下載的139條炭疽菌ITS序列的ML系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

炭疽病是糧食、經(jīng)濟(jì)、果樹、花卉、蔬菜等重要作物上的一種比較嚴(yán)重的病害，不僅會(huì)影響作物的產(chǎn)量，還會(huì)影響作物的品質(zhì)。掌握病害的為害狀況對(duì)炭疽病的防控有重要的指導(dǎo)意義。筆者對(duì)昭通綏江半邊紅李炭疽病為害狀況調(diào)查表明，會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村和新灘鎮(zhèn)鰱魚村的半邊紅李果園有不同程度的炭疽病危害，其中新灘鎮(zhèn)鰱魚村比會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村的危害程度嚴(yán)重，新灘鰱魚村的發(fā)病率達(dá)到50%，病情指數(shù)為78.5；從海拔梯度來(lái)看，500～700 m海拔危害程度最嚴(yán)重。因此，對(duì)炭疽病為害較嚴(yán)重的半邊紅李果園要加強(qiáng)防控，且重點(diǎn)關(guān)注海拔500 m以上的果園。

病原菌的鑒定對(duì)病害的確診及防治有重要的參考價(jià)值。炭疽病菌因分布廣泛，寄主范圍復(fù)雜多樣，形態(tài)特征差異較大而使其系統(tǒng)分類也變得撲朔迷離。其分類歷史經(jīng)歷了依靠寄主階段、寄主上繁殖體顯微形態(tài)特征及純培養(yǎng)特征階段、純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子和附著孢形態(tài)特征大小及純培養(yǎng)物特征和寄主范圍階段，一直到現(xiàn)在的分子生物技術(shù)手段結(jié)合分生孢子和附著孢的形態(tài)特征及大小階段。每個(gè)分類階段都對(duì)炭疽菌的分類知識(shí)有新的認(rèn)知。由于形態(tài)特征穩(wěn)定性差且易受培養(yǎng)條件的影響，單獨(dú)依靠形態(tài)特征進(jìn)行系統(tǒng)分析是不可靠的，所以利用遺傳特征穩(wěn)定的性狀來(lái)研究炭疽菌種間差異和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系非常關(guān)鍵。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展對(duì)真菌分類造成了很大的影響。目前炭疽菌的分類依據(jù)主要結(jié)合前輩的分類系統(tǒng)，以附著孢、分生孢子的形態(tài)特征、大小，純培養(yǎng)特征以及進(jìn)化速率合適的分子片段的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來(lái)確定其歸屬?；贏pMat標(biāo)記，芒果炭疽菌屬于C.siamensesensulato，包括C.jasminisambac、C.hymenocallidis、C.melanocaulon和C.siamensesensustricto等4個(gè)種以及3個(gè)新的潛在的未定名的系譜[14]。北京4個(gè)地區(qū)楊樹炭疽病由膠孢炭疽菌(C.gloeosporioideoes)和新種C.populi引起[27]。中國(guó)茶樹炭疽病菌基于形態(tài)特征和分子系統(tǒng)分析鑒定為尖孢炭疽復(fù)合群和膠孢炭疽復(fù)合群[36]。比利時(shí)蘋果苦腐病果實(shí)中分離鑒定了6種炭疽菌，分別是C.godetiae、C.fioriniae、C.salicis、疑似C.kahawae、C.nymphaeae、C.rhombiforme和C.acutatum，分屬膠孢炭疽復(fù)合群和尖孢炭疽復(fù)合群[37]。其中C.godetiae是比利時(shí)果園中最常見的致病菌。不同國(guó)家不同地區(qū)辣椒約有10多種炭疽菌引起炭疽病[38-43]。例如，美國(guó)辣椒炭疽病由C.acutatum、C.coccodes和C.gloeosporioides引起；澳大利亞辣椒炭疽病由C.acutatum、C.dematium、C.gloeosporioides和C.truncatum引起；韓國(guó)辣椒炭疽病由C.acutatum、C.coccodes、C.dematium、C.gloeosporioides和C.panacicola等引起[43]。印度辣椒炭疽病是由C.coccodes、C.fructicola、C.siamense和C.truncatum引起的[42]；中國(guó)辣椒炭疽病由C.acutatum、C.gloeosporioides、C.truncatum、C.coccodes、C.fioriniae、C.fructicola、C.scovillei、C.conoides、C.grossum、C.liaoningense、C.aenigma、C.cliviae、C.endophytica、C.hymenocallidis、C.incanum、C.karstii和C.viniferum等引起[38-39,41]。因此，炭疽病菌不僅因寄主而多樣復(fù)雜，也因不同地域而多樣化。

本研究首次對(duì)中國(guó)李樹地方品種半邊紅李上的炭疽病病原菌進(jìn)行了分離，獲得4種類型分生孢子，經(jīng)回接驗(yàn)證均對(duì)李子葉片致病。僅從半邊紅李炭疽菌分生孢子形態(tài)來(lái)看，18-4-C2與其他菌株形態(tài)差異較大，分生孢子具1～3根附屬絲。附屬絲被認(rèn)為是尾狀炭疽復(fù)合群中炭疽菌特有的形態(tài)特征[16]，但I(xiàn)TS序列分析暗示18-4-C2并不屬于尾狀炭疽復(fù)合群。由于附屬絲環(huán)境條件的不同而變化[44]，其作為炭疽菌的分類特征存在爭(zhēng)議，因此18-4-C2是否是膠孢炭疽復(fù)合群的新種有待進(jìn)一步研究。結(jié)合分生孢子形態(tài)大小、菌落特征及其ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹，初步將所分離到的炭疽菌歸入膠孢炭疽復(fù)合群C.gloeosporioidescomplex species和暹羅炭疽復(fù)合群C.siamensecomplex species。系統(tǒng)樹表明半邊紅李炭疽菌與膠孢炭疽復(fù)合群中的C.clidemiae、C.fructicola、C.aeschynomenes及暹羅炭疽復(fù)合群中的C.hymenocallidis有一定的聯(lián)系（圖4），但支持率不高，且分生孢子形態(tài)及菌落與這些相關(guān)種之間存在一定差異。僅從涉及的復(fù)合群可以看出，半邊紅李炭疽菌與韓國(guó)日本李炭疽菌部分相同。這個(gè)結(jié)果與辣椒炭疽菌結(jié)果類同，即不同區(qū)域相同寄主炭疽菌種類不同。為明確中國(guó)李樹炭疽病的種類，還應(yīng)對(duì)其他地區(qū)的李樹炭疽病進(jìn)行鑒定。

膠孢炭疽復(fù)合群包括C.asianum、C.cordylinicola、C.fructicola、C.gloeosporioides、C.horii、C.kahawaesubsp.Kahawae、C.musae、C.nupharicola、C.psidii、C.siamense、C.theobromicola、C.tropicale、C.xanthorrhoeae、C.aenigma、C.aeschynomenes、C.alatae、C.alienum、C.aotearoa、C.clidemiae、C.kahawaesubsp.Ciggaro、C.salsolae、C.ti和C.queenslandicum等22種1個(gè)亞種[15]，暹羅炭疽復(fù)合群包括C.jasmini-sambac、C.hymenocallidis、C.dianesei、C.siamense、C.endomangiferae、C.communis及身份模糊的C.murrayae等7個(gè)種[45]。由于膠孢炭疽復(fù)合群和暹羅炭疽復(fù)合群所涉及的種類較多，且ITS標(biāo)記并不能很好地區(qū)分膠孢炭疽復(fù)合群和暹羅炭疽復(fù)合群內(nèi)一些種間的關(guān)系[14-15]，因此綏江半邊紅李炭疽菌的鑒定還有待聯(lián)合多個(gè)分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

云南省綏江半邊紅李炭疽病為害狀況調(diào)查表明半邊紅李果園有不同程度的炭疽病危害，其中新灘鎮(zhèn)鰱魚村比會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪村的危害程度嚴(yán)重，新灘鰱魚村的發(fā)病率達(dá)到50%，病情指數(shù)為78.5，會(huì)儀鎮(zhèn)黃坪的發(fā)病率達(dá)到20%，病情指數(shù)為20.4；且500～700 m海拔危害程度最嚴(yán)重。

單孢分離獲得15株李炭疽病分離株，各分離株平板菌落形態(tài)略有差異，獲得4類不同的分生孢子，經(jīng)回接驗(yàn)證均致病。rDNA ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化分析初步推定半邊紅李炭疽病的病原菌為膠孢炭疽復(fù)合群Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex和暹羅炭疽復(fù)合群C.siamensespeciescomplex。

與韓國(guó)研究人員對(duì)日本李樹炭疽菌所屬種類比較，半邊紅李炭疽菌不涉及尖孢炭疽復(fù)合群中的種類，涉及的膠孢炭疽復(fù)合群和暹羅炭疽復(fù)合群中的種類是否與韓國(guó)的相同有待半邊紅李炭疽菌種類確定后再做討論。僅從涉及的復(fù)合群可以看出，半邊紅李炭疽菌與韓國(guó)日本李炭疽菌部分相同。