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    5株纖維菌屬菌株的分離、鑒定及產(chǎn)酶活性研究

    2021-05-27 06:00:12王光琴溫明霞芶劍渝丁夢嬌
    中國農(nóng)學(xué)通報 2021年15期

    王光琴,黃 鶯,溫明霞,芶劍渝,代 飛,丁夢嬌

    (1貴州大學(xué)煙草學(xué)院,貴陽 550025;2貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025;3貴州省煙草公司遵義市公司,貴州遵義 563000;4貴州省煙草公司安順市公司,貴州安順 561000)

    0 引言

    全世界秸稈年產(chǎn)量超過29億t,中國是糧食生產(chǎn)大國,也是秸稈生產(chǎn)大國,每年生產(chǎn)的作物秸桿超過7億t,約占全世界秸稈總量的20%~30%[1]。作物秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生物質(zhì)副產(chǎn)品,具有巨大的潛在利用價值[2],特別是在改良土壤養(yǎng)分上被廣泛認(rèn)可。秸稈還田可為作物生長提供必需的C、N等營養(yǎng)元素,也能改善土壤通氣疏水性,是構(gòu)建肥沃耕層、提升土壤質(zhì)量的重要措施[3-4]。作物秸稈結(jié)構(gòu)極為穩(wěn)定,其中纖維素是主要成分,占總量的35%~50%,是自然界中儲量最豐富的生物高分子[5],只有濃酸溶液、高濃度的氯化鋅水溶液、銅氨溶液和離子液體才可能破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)使其溶解[6]。所以秸稈直接還田降解速度慢不僅影響下茬作物的種植,還田不當(dāng)也會造成農(nóng)田面源污染[7]。

    生物降解法是綠色高效分解纖維素的主要途徑之一,近年來,中外大量學(xué)者從多種材料中篩選出具有纖維素降解能力的菌株,菌劑的施用不僅有效加快秸稈腐解,還對土壤養(yǎng)分、土壤微生物及作物產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。金海洋等[8]研究表明與秸稈直接還田相比,水稻秸稈還田中應(yīng)用由分解纖維素的芽抱桿菌屬(Bacillus)和分解脂肽梭菌屬(Clostridium)7個菌株組成的菌劑,可以降低水稻秸稈的強(qiáng)度,增加土壤纖維素酶的活性,加速秸稈的降解,增加下季作物產(chǎn)量。趙偉等[9]通過3年菌劑降解秸稈直接還田試驗(yàn),菌劑降解秸稈直接還田增加了土壤有機(jī)質(zhì)、微生物量碳、全氮、微生物量氮含量和C/N。Hart等[10]篩選的一株真菌添施于小麥秸稈,顯著降低了其C/N值,提高了土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性。

    但大部分篩選的秸稈分解菌劑存在生產(chǎn)周期長,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,易污染,纖維素酶活較低等問題?;诖耍狙芯恳再F州典型煙區(qū)植煙土壤為高效篩選纖維素分解菌材料,以玉米秸稈粉為碳源,旨在篩選出具有高效降解玉米秸稈能力、適宜于貴州煙區(qū)秸稈還田適用菌株。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 土樣采集 供高效纖維素分解菌篩選的土壤以無菌方式采自貴州典型植煙區(qū)安順、畢節(jié)和遵義,玉米秸稈粉來自安順平壩。試驗(yàn)是在貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,于2019年11月—2020年10月份進(jìn)行。

    1.1.2 主要培養(yǎng)基及主要試劑 培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基[11];分離培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基,馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基,改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基[12];鑒別培養(yǎng)基(CMC培養(yǎng)基)[13];液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[14]。

    試劑:0.1%剛果紅染液;0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8);1%CMC-Na溶液;3,5-二硝基水楊酸顯色劑[15]。

    1.2 研究方法

    1.2.1 纖維素分解菌的富集、分離純化與初篩 稱取10.0 g土樣于90 mL滅菌含玻璃珠的蒸餾水中,并在搖床上以150 r/min振蕩1 h后靜置5 min,隨后取2 mL上清液于已滅菌冷卻的富集培養(yǎng)基中,20℃180 r/min振蕩培養(yǎng)3天。按無菌操作要求,將富集后的培養(yǎng)液梯度稀釋,取稀釋液10-6、10-7、10-80.1 mL涂布于NA培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離、取稀釋液10-4、10-5、10-60.1 mL分別涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基用于真菌的分離和高氏一號培養(yǎng)基用于放線菌的分離。每個梯度分別設(shè)置3組平行,細(xì)菌于37℃倒置培養(yǎng)1~2天,真菌、放線菌于28℃倒置培養(yǎng)6~7天。將平板中長出的單菌落在相應(yīng)培養(yǎng)基中純化,用無菌接種環(huán)挑取純化單菌株三點(diǎn)法將其點(diǎn)接在CMC-Na鑒別培養(yǎng)基上,選擇能在培養(yǎng)基上生長的菌株,用0.1%剛果紅染液染色10 min,再用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min,倒出平板上多余的溶液,最后,根據(jù)培養(yǎng)基平板上透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小,初步篩選出纖維素優(yōu)勢分解菌。

    1.2.2 菌株拮抗實(shí)驗(yàn) 將初篩純化后獲得的單菌株于LB培養(yǎng)基上兩兩相交劃線,28℃倒置培養(yǎng)2~3天,待長豐滿看菌株相交處是否有抑菌圈產(chǎn)生,沒有抑菌圈產(chǎn)生表示菌株間沒有拮抗作用,可進(jìn)行復(fù)合菌劑的制備。

    1.2.3 生長曲線測定 挑取純化活化單菌株于LB培養(yǎng)基中28℃180 r/min培養(yǎng),每隔4 h取樣,用可見分光光度計(jì)測定其濃度,繪制生長曲線,對濃度大的菌懸液用未接種的LB培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定,使其OD值在0.10~0.65以內(nèi),經(jīng)稀釋后測得的OD值乘以稀釋倍數(shù)。

    1.2.4 單菌株及復(fù)合菌劑的酶活測定

    (1)粗酶液的制備。分別將在CMC-Na鑒別培養(yǎng)基上D/d值大于2.5的純化菌株于LB培養(yǎng)基28℃180 r/min振蕩培養(yǎng)制成種子液。取2 mL的種子液接種至100 mL的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃180 r/min的搖床中培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)10天后5000 r/min離心15 min,收集上清,作為粗酶提取液。

    (2)羧甲基纖維素鈉酶活力(CMCase)測定。取0.5 mL粗酶液,依據(jù)劉霄[16]測定纖維素酶活方法,得出菌株纖維素酶活性,每隔24 h取樣測定。酶活力單位(U/mL)定義為:1 mL酶液1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需要的纖維素酶量為一個單位酶活。

    1.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

    將菌株分別于LB培養(yǎng)基與高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行純化,菌株生長穩(wěn)定進(jìn)行菌落形態(tài)描述。采用革蘭氏染色法對篩選得到的纖維素分解菌進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn),通過顯微鏡觀察形態(tài)特征,通過染色反應(yīng)呈現(xiàn)顏色不同判定屬革蘭氏陽性菌(G+)或革蘭氏陰性菌(G-)。

    1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

    1.4.1 菌株DNA的提取 本研究選擇使用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行菌株DNA的提取。

    1.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌16SrDNA通用引物,正向引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3'),反向引物為 1492R(5'-GGTTACC TTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系25 μL:1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL,引物 27 F(10 μmol/L)1.0 μL,引物 1492 R(10 μmol/L)1.0 μL,Template DNA 1 μL。PCR熱循環(huán)條件:98℃預(yù)變性2 min 98℃變性10 min,55℃退火 10 s,72℃延伸 20 s,72℃修復(fù)延伸 2 min,4℃終止反應(yīng)∞,32個循環(huán)。取2 μL PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

    1.4.3 序列測定 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定條帶亮度。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進(jìn)行基因序列的測定,將測序結(jié)果通過國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索。并利用MEGA X.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.5 菌株對玉米秸稈降解率的測定

    選擇最佳處理菌劑(單菌劑或復(fù)合菌劑)以5%的接種量添施于已滅菌的玉米秸稈,通過失重法測定其降解率。秸稈處理為2~3 cm長度,稱取20 g放置于500 mL的容量瓶蓋上封口膜以保持其充足的透氣空間而不被污染,將容量瓶放置于室溫(28℃左右)下,約2天晃動一次,當(dāng)觀察到明顯腐解現(xiàn)象時測定其降解率。將培養(yǎng)相應(yīng)時間的秸稈用無菌水清洗數(shù)次以除去秸稈表面大量菌體,棄去液體部分,60℃烘干至恒重后稱重計(jì)算失重率。秸稈腐解率的計(jì)算見公式(1)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 纖維素分解菌的富集、分離與純化

    通過以玉米秸稈為唯一碳源富集培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)菌、放線菌、真菌培養(yǎng)基上單菌株的分離、純化,最終共獲得純菌株44株。

    2.2 纖維素分解菌的初篩

    通過在CMC鑒別培養(yǎng)基平板上利用剛果紅染色法對分離純化的菌株進(jìn)行染色,對纖維素分解菌進(jìn)行初步篩選。根據(jù)培養(yǎng)基平板上是否能產(chǎn)生水解圈以及透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小,初步篩選出能夠分解纖維素以及降解效果較好的菌株,共20株,其中細(xì)菌8株、放線菌8株、真菌4株。D/d越大,說明菌株產(chǎn)生的纖維素酶活性高或其纖維素酶量越大,因此初步篩選出5株優(yōu)勢纖維素分解菌,其中3株來源于遵義湄潭煙區(qū)土壤,命名為FCM-1、FCM-10、FCM-11、1株來源于安順楊武煙區(qū)土壤,命名為FCY-2,1株來源于畢節(jié)威寧植煙土壤,命名為FCW-2。經(jīng)過2天培養(yǎng)后,剛果紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),5株菌株菌體直徑較小(約為0.2 cm)卻產(chǎn)生了較大的透明圈(圖1),其中比值最大的是FCM-10,D/d為4.2(表1)。

    圖1 纖維素分解菌菌株剛果紅染色

    表1 纖維素分解菌菌株剛果紅染色初篩結(jié)果

    2.3 纖維素分解菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

    通過對初篩出的5株纖維素分解菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,5株菌株生長交接處無抑菌圈或抑生孢子產(chǎn)生,說明菌株間無拮抗作用,可進(jìn)行復(fù)合菌劑的配制。通過菌株兩兩配制,共得到10個復(fù)合菌劑。這可能是由于這些菌株都是由貴州煙區(qū)植煙土壤中篩選而得,生長環(huán)境大致相同,所以菌株間無拮抗作用。

    2.4 纖維素分解菌生長曲線的測定

    通過對5株纖維素分解菌生長曲線的測定(圖2),可知5株菌株4~12 h為生長遲緩期,16 h開始一直到44 h較快增長,48 h后趨于穩(wěn)定。對數(shù)期酶系活躍,代謝旺盛,所以選擇16~44 h時間段作為提取菌株DNA最佳時期以及測定酶活最佳接種期。

    圖2 纖維素分解菌菌株生長曲線

    2.5 纖維素分解菌酶活力測定

    通過發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng),對菌株FCM-1、FCM-10、FCM-11、FCY-2和FCW-2及其配制的復(fù)合菌劑共15個處理分別于2、5和7天測定其CMCase活性,結(jié)果表明(表2),5株纖維素分解菌單菌株中FCM-10菌株除了5天時與FCM-11差異不顯著,在2天和7天時CMCase活性最大,在7天達(dá)最大(260.45 U/mL)與其他單菌株呈顯著性差異,其次為FCM-11菌株,在5天達(dá)最大(243.85 U/mL)。在10種復(fù)合菌劑中,不同時間不同菌株復(fù)合所產(chǎn)酶活不同,在2天時CMCase活性值最大的是15號菌劑FCY-2+FCW-2,達(dá)290.38 U/mL,是其單菌株的1.48倍和1.98倍;在5天時CMCase活性值最大的是11號菌劑FCM-10+FCY-2,達(dá)314.39 U/mL,是其單菌株的1.2倍和1.53倍;在7天時CMCase活性值最大的是6號菌劑FCM-1+FCM-10,達(dá)358.11 U/mL,是其單菌株的2.51倍和1.37倍。

    表2 纖維素分解菌菌株及其復(fù)合菌劑CMC酶活性

    2.6 5株纖維素分解菌菌株鑒定

    2.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將5株纖維素分解菌分別于LB培養(yǎng)基與高氏一號培養(yǎng)基平板上劃線純化,28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48 h后觀察。5株高效纖維素分解菌在同一種培養(yǎng)基上外觀形態(tài)差異不大,但在不同培養(yǎng)基之間卻有較大差別(圖3)。2種培養(yǎng)基上生長的菌落在大小、顏色、形成單菌落的劃線區(qū)、生長速度不相同。LB培養(yǎng)基上的菌落顏色為檸檬黃,菌落略大(0.2~0.4 cm),約2天于劃線C區(qū)長出單菌落,易挑起;而高氏一號培養(yǎng)基的菌落顏色較淺,偏白,菌落小(0.1~0.2 cm),約4天于劃線B區(qū)長出單菌落,C區(qū)菌落數(shù)較少,不易挑起。2種培養(yǎng)基上的菌落都為圓形、濕潤、光滑、隆起、有光澤、不透明,有可見基質(zhì)菌絲。5株菌株都為革蘭氏陽性菌,在油鏡下觀察菌體細(xì)短而密集。

    圖3 維素分解菌菌株形態(tài)及其革蘭氏染色

    2.6.2 分子生物學(xué)鑒定 對5株纖維素分解菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上驗(yàn)證,得到1500 bp左右的條帶,送至北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進(jìn)行基因序列的測定,F(xiàn)CM-1、FCM-10、FCM-11、FCY-2和FCW-2菌株的序列長度分別為1359、1355、1373、1373、1337、1364 bp。將測得的序列在NCBI中比對,發(fā)現(xiàn)其與Cellulosimicrobium cellulans與Cellulosimicrobiumfunkei16S rDNA序列一致性高達(dá)100%。將測序序列信息提交Genbank,下載該屬其他序列及所隸屬科相近序列,利用MEGA X基于鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示此5株菌隸屬于Cellulosimicrobium屬,與Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei及Cellulosimicrobiumaquatile,結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色結(jié)果,可初步判定該菌隸屬纖維菌屬(Cellulosimicrobium)。

    圖4 基于16S rDNA序列同源性纖維素分解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.7 菌株對玉米秸稈的降解率測定

    通過5株菌株及其復(fù)合菌劑的纖維素酶活測定,F(xiàn)CM-10+FCY-2菌劑在時間(5天)與酶活(314.39 U/mL)綜合優(yōu)于其他處理,所以將FCM-10+FCY-2作為優(yōu)勢菌劑進(jìn)行玉米秸稈降解實(shí)驗(yàn),將其單菌劑與未添施菌劑處理設(shè)置為對照。培養(yǎng)25天后,菌劑處理秸稈相較未添施菌劑處理秸稈來看,顏色變黑、腐爛,秸稈微微塌陷,三角瓶底部也出現(xiàn)了少量液體,其中復(fù)合菌劑處理出現(xiàn)乳白色液體(圖5)。通過對秸稈降解率測定可以看出(圖6),菌劑處理降解率高于未添施菌劑處理,經(jīng)過25天降解,復(fù)合菌劑降解率達(dá)53.35%,是對照的1.87倍,是單菌劑處理的1倍多,F(xiàn)CM-10處理略高于FCY-2處理。表明FCM-10+FCY-2復(fù)合菌劑對玉米秸稈的降解作用強(qiáng)于單菌劑及未添施菌劑處理,具有實(shí)際應(yīng)用價值。

    圖5 25天玉米秸稈的降解外觀形態(tài)變化

    圖6 25天各菌劑玉米秸稈的降解率

    3 討論

    研究從貴州典型植煙土壤中篩選獲得5株具有高效降解纖維素的微生物菌劑,通過形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析,初步鑒定為Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobiumfunkei,目前cellulosimicrobiumsp.對于秸稈生物質(zhì)資源降解的研究較少,該菌株具有較高的纖維素酶活,菌株間復(fù)合其纖維素酶活高于單菌株,并對秸稈表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解率,是有效降解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)品的微生物資源。cellulosimicrobiumsp.作為纖維素與半纖維素分解的微生物,目前僅包括7個有效發(fā)表的種(www.bacterio.net/chryseobacterium.html),各菌株可產(chǎn)生多種降解酶,如葡萄糖苷酶、蛋白酶、糖苷水解酶和幾丁質(zhì)酶,廣泛應(yīng)用于纖維素和木聚糖的生物降解和酒精發(fā)酵[17]。Cellulosimicrobiumcellulans通過凝脂多糖(EPS)中的木聚糖體粘附于纖維素表面,從而有效降解纖維素底物[18]。該菌株于多種生境中分離出,可降解苯并(a)芘(BaP)[19]、高集凝乳凝膠[20]、海洋污染物烴等碳?xì)浠衔颷21]等,且具有較高的木糖酶活促進(jìn)了7-木糖紫杉烷向紫杉醇的轉(zhuǎn)化[22]。Cellulosimicrobiumfunkei從人類學(xué)液中分離得到[23],研究表明該菌株具有較高的Cr(Ⅵ)還原能力,可降低其毒性,進(jìn)行土壤修復(fù)[24]、可降解黃曲霉毒素B1[25],以保護(hù)作物生長。Cellulosimicrobiumcellulans和Cellulosimicrobiumfunkei是對于環(huán)境友好、資源有效利用的優(yōu)質(zhì)微生物資源。

    5株來源地不同的纖維素分解菌菌株經(jīng)鑒定具有較高的同源性,但相同培養(yǎng)條件下菌株間酶活存在差異,說明即使同屬相同的種,研究所篩選得到的菌株間仍存在差異,這與劉霄[17]、王元明等[26]的研究結(jié)果相似,進(jìn)一步區(qū)別還需驗(yàn)證。根據(jù)前人研究成果,Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei是非常重要的微生物資源,將Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei制成菌劑添施于秸稈資源還田對于資源充分利用與修復(fù)損壞土壤具有重要意義。

    貴州因其特殊的地形地貌使得植煙土地破碎而不連貫,限制了秸稈還田技術(shù)與規(guī)模的發(fā)展,作為烤煙主要輪作作物秸稈——玉米秸稈,將其有效還田對于克服烤煙連作或單一輪作障礙具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。就地篩選得到的菌株添施秸稈原位還田具有生態(tài)適應(yīng)性的特點(diǎn),實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    4 結(jié)論

    本研究以貴州典型煙區(qū)植煙土壤為高效篩選纖維素分解菌材料,以玉米秸稈粉為唯一碳源,通過初篩、復(fù)篩獲得高效纖維素分解菌5株。其中透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小在2.8~4.2之間,其中以一株湄潭菌株D/d最大,為4.2。通過CMCase活力測定結(jié)果顯示,菌株間的復(fù)合酶活優(yōu)于單菌株,在5天時FCM-10+FCY-2 CMCase活性達(dá)314.39 U/mL,是其單菌株的1.2倍和1.53倍,表明5株菌雖都屬于Cellulosimicrobium cellulans與Cellulosimicrobium funkei,且具有較高的同源性(100%)但菌株間仍存在差異,可能是由于生產(chǎn)適宜環(huán)境(溫度等)不同或不能發(fā)酵核糖和糖原等原因[27]。選擇最佳復(fù)合菌劑處理FCM-10+FCY-2制成菌劑降解玉米秸稈,25天時秸稈外觀出現(xiàn)變化,與對照相比其顏色變黑、秸稈腐爛,微微塌陷,秸稈降解率達(dá)53.35%,是對照的1.87倍,是單菌劑處理的1倍多。結(jié)果表明,5株纖維素分解菌具有較好的玉米秸稈降解能力,是適宜于貴州煙區(qū)秸稈還田的潛力菌株。由于5株菌株的高度相似于Cellulosimicrobium cellulans和Cellulosimicrobium funkei都達(dá)100%,系統(tǒng)發(fā)育樹無法精準(zhǔn)區(qū)別,還需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定工作;菌株的降解特性、降解機(jī)理等多方面內(nèi)容也還需作進(jìn)一步的深入研究。

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