5株纖維菌屬菌株的分離、鑒定及產(chǎn)酶活性研究

王光琴，黃 鶯，溫明霞，芶劍渝，代 飛，丁夢(mèng)嬌

（1貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽 550025；2貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；3貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義 563000；4貴州省煙草公司安順市公司，貴州安順 561000）

0 引言

全世界秸稈年產(chǎn)量超過29億t，中國是糧食生產(chǎn)大國，也是秸稈生產(chǎn)大國，每年生產(chǎn)的作物秸桿超過7億t，約占全世界秸稈總量的20%～30%[1]。作物秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生物質(zhì)副產(chǎn)品，具有巨大的潛在利用價(jià)值[2]，特別是在改良土壤養(yǎng)分上被廣泛認(rèn)可。秸稈還田可為作物生長(zhǎng)提供必需的C、N等營(yíng)養(yǎng)元素，也能改善土壤通氣疏水性，是構(gòu)建肥沃耕層、提升土壤質(zhì)量的重要措施[3-4]。作物秸稈結(jié)構(gòu)極為穩(wěn)定，其中纖維素是主要成分，占總量的35%～50%，是自然界中儲(chǔ)量最豐富的生物高分子[5]，只有濃酸溶液、高濃度的氯化鋅水溶液、銅氨溶液和離子液體才可能破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)使其溶解[6]。所以秸稈直接還田降解速度慢不僅影響下茬作物的種植，還田不當(dāng)也會(huì)造成農(nóng)田面源污染[7]。

生物降解法是綠色高效分解纖維素的主要途徑之一，近年來，中外大量學(xué)者從多種材料中篩選出具有纖維素降解能力的菌株，菌劑的施用不僅有效加快秸稈腐解，還對(duì)土壤養(yǎng)分、土壤微生物及作物產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。金海洋等[8]研究表明與秸稈直接還田相比，水稻秸稈還田中應(yīng)用由分解纖維素的芽抱桿菌屬(Bacillus)和分解脂肽梭菌屬(Clostridium)7個(gè)菌株組成的菌劑，可以降低水稻秸稈的強(qiáng)度，增加土壤纖維素酶的活性，加速秸稈的降解，增加下季作物產(chǎn)量。趙偉等[9]通過3年菌劑降解秸稈直接還田試驗(yàn)，菌劑降解秸稈直接還田增加了土壤有機(jī)質(zhì)、微生物量碳、全氮、微生物量氮含量和C/N。Hart等[10]篩選的一株真菌添施于小麥秸稈，顯著降低了其C/N值，提高了土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性。

但大部分篩選的秸稈分解菌劑存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，易污染，纖維素酶活較低等問題?；诖?，本研究以貴州典型煙區(qū)植煙土壤為高效篩選纖維素分解菌材料，以玉米秸稈粉為碳源，旨在篩選出具有高效降解玉米秸稈能力、適宜于貴州煙區(qū)秸稈還田適用菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土樣采集 供高效纖維素分解菌篩選的土壤以無菌方式采自貴州典型植煙區(qū)安順、畢節(jié)和遵義，玉米秸稈粉來自安順平壩。試驗(yàn)是在貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于2019年11月—2020年10月份進(jìn)行。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及主要試劑 培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基[11]；分離培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，改良高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基[12]；鑒別培養(yǎng)基（CMC培養(yǎng)基）[13]；液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[14]。

試劑：0.1%剛果紅染液；0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)；1%CMC-Na溶液；3,5-二硝基水楊酸顯色劑[15]。

1.2 研究方法

1.2.1 纖維素分解菌的富集、分離純化與初篩 稱取10.0 g土樣于90 mL滅菌含玻璃珠的蒸餾水中，并在搖床上以150 r/min振蕩1 h后靜置5 min，隨后取2 mL上清液于已滅菌冷卻的富集培養(yǎng)基中，20℃180 r/min振蕩培養(yǎng)3天。按無菌操作要求，將富集后的培養(yǎng)液梯度稀釋，取稀釋液10-6、10-7、10-80.1 mL涂布于NA培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離、取稀釋液10-4、10-5、10-60.1 mL分別涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基用于真菌的分離和高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于放線菌的分離。每個(gè)梯度分別設(shè)置3組平行，細(xì)菌于37℃倒置培養(yǎng)1～2天，真菌、放線菌于28℃倒置培養(yǎng)6～7天。將平板中長(zhǎng)出的單菌落在相應(yīng)培養(yǎng)基中純化，用無菌接種環(huán)挑取純化單菌株三點(diǎn)法將其點(diǎn)接在CMC-Na鑒別培養(yǎng)基上，選擇能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，用0.1%剛果紅染液染色10 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min，倒出平板上多余的溶液，最后，根據(jù)培養(yǎng)基平板上透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小，初步篩選出纖維素優(yōu)勢(shì)分解菌。

1.2.2 菌株拮抗實(shí)驗(yàn) 將初篩純化后獲得的單菌株于LB培養(yǎng)基上兩兩相交劃線，28℃倒置培養(yǎng)2～3天，待長(zhǎng)豐滿看菌株相交處是否有抑菌圈產(chǎn)生，沒有抑菌圈產(chǎn)生表示菌株間沒有拮抗作用，可進(jìn)行復(fù)合菌劑的制備。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 挑取純化活化單菌株于LB培養(yǎng)基中28℃180 r/min培養(yǎng)，每隔4 h取樣，用可見分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的LB培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其OD值在0.10～0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測(cè)得的OD值乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.4 單菌株及復(fù)合菌劑的酶活測(cè)定

（1）粗酶液的制備。分別將在CMC-Na鑒別培養(yǎng)基上D/d值大于2.5的純化菌株于LB培養(yǎng)基28℃180 r/min振蕩培養(yǎng)制成種子液。取2 mL的種子液接種至100 mL的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃180 r/min的搖床中培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)10天后5000 r/min離心15 min，收集上清，作為粗酶提取液。

（2）羧甲基纖維素鈉酶活力(CMCase)測(cè)定。取0.5 mL粗酶液，依據(jù)劉霄[16]測(cè)定纖維素酶活方法，得出菌株纖維素酶活性，每隔24 h取樣測(cè)定。酶活力單位(U/mL)定義為：1 mL酶液1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需要的纖維素酶量為一個(gè)單位酶活。

1.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株分別于LB培養(yǎng)基與高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行純化，菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定進(jìn)行菌落形態(tài)描述。采用革蘭氏染色法對(duì)篩選得到的纖維素分解菌進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，通過顯微鏡觀察形態(tài)特征，通過染色反應(yīng)呈現(xiàn)顏色不同判定屬革蘭氏陽性菌(G+)或革蘭氏陰性菌(G-)。

1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 菌株DNA的提取 本研究選擇使用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行菌株DNA的提取。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌16SrDNA通用引物，正向引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3')，反向引物為 1492R(5'-GGTTACC TTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，引物 27 F(10 μmol/L)1.0 μL，引物 1492 R(10 μmol/L)1.0 μL，Template DNA 1 μL。PCR熱循環(huán)條件：98℃預(yù)變性2 min 98℃變性10 min，55℃退火 10 s，72℃延伸 20 s，72℃修復(fù)延伸 2 min，4℃終止反應(yīng)∞，32個(gè)循環(huán)。取2 μL PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4.3 序列測(cè)定 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定條帶亮度。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進(jìn)行基因序列的測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果通過國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索。并利用MEGA X.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株對(duì)玉米秸稈降解率的測(cè)定

選擇最佳處理菌劑（單菌劑或復(fù)合菌劑）以5%的接種量添施于已滅菌的玉米秸稈，通過失重法測(cè)定其降解率。秸稈處理為2～3 cm長(zhǎng)度，稱取20 g放置于500 mL的容量瓶蓋上封口膜以保持其充足的透氣空間而不被污染，將容量瓶放置于室溫（28℃左右）下，約2天晃動(dòng)一次，當(dāng)觀察到明顯腐解現(xiàn)象時(shí)測(cè)定其降解率。將培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間的秸稈用無菌水清洗數(shù)次以除去秸稈表面大量菌體，棄去液體部分，60℃烘干至恒重后稱重計(jì)算失重率。秸稈腐解率的計(jì)算見公式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的富集、分離與純化

通過以玉米秸稈為唯一碳源富集培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)菌、放線菌、真菌培養(yǎng)基上單菌株的分離、純化，最終共獲得純菌株44株。

2.2 纖維素分解菌的初篩

通過在CMC鑒別培養(yǎng)基平板上利用剛果紅染色法對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行染色，對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行初步篩選。根據(jù)培養(yǎng)基平板上是否能產(chǎn)生水解圈以及透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小，初步篩選出能夠分解纖維素以及降解效果較好的菌株，共20株，其中細(xì)菌8株、放線菌8株、真菌4株。D/d越大，說明菌株產(chǎn)生的纖維素酶活性高或其纖維素酶量越大，因此初步篩選出5株優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌，其中3株來源于遵義湄潭煙區(qū)土壤，命名為FCM-1、FCM-10、FCM-11、1株來源于安順楊武煙區(qū)土壤，命名為FCY-2，1株來源于畢節(jié)威寧植煙土壤，命名為FCW-2。經(jīng)過2天培養(yǎng)后，剛果紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5株菌株菌體直徑較小（約為0.2 cm）卻產(chǎn)生了較大的透明圈（圖1），其中比值最大的是FCM-10，D/d為4.2（表1）。

圖1 纖維素分解菌菌株剛果紅染色

表1 纖維素分解菌菌株剛果紅染色初篩結(jié)果

2.3 纖維素分解菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)初篩出的5株纖維素分解菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，5株菌株生長(zhǎng)交接處無抑菌圈或抑生孢子產(chǎn)生，說明菌株間無拮抗作用，可進(jìn)行復(fù)合菌劑的配制。通過菌株兩兩配制，共得到10個(gè)復(fù)合菌劑。這可能是由于這些菌株都是由貴州煙區(qū)植煙土壤中篩選而得，生長(zhǎng)環(huán)境大致相同，所以菌株間無拮抗作用。

2.4 纖維素分解菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過對(duì)5株纖維素分解菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（圖2），可知5株菌株4～12 h為生長(zhǎng)遲緩期，16 h開始一直到44 h較快增長(zhǎng)，48 h后趨于穩(wěn)定。對(duì)數(shù)期酶系活躍，代謝旺盛，所以選擇16～44 h時(shí)間段作為提取菌株DNA最佳時(shí)期以及測(cè)定酶活最佳接種期。

圖2 纖維素分解菌菌株生長(zhǎng)曲線

2.5 纖維素分解菌酶活力測(cè)定

通過發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，對(duì)菌株FCM-1、FCM-10、FCM-11、FCY-2和FCW-2及其配制的復(fù)合菌劑共15個(gè)處理分別于2、5和7天測(cè)定其CMCase活性，結(jié)果表明（表2），5株纖維素分解菌單菌株中FCM-10菌株除了5天時(shí)與FCM-11差異不顯著，在2天和7天時(shí)CMCase活性最大，在7天達(dá)最大(260.45 U/mL)與其他單菌株呈顯著性差異，其次為FCM-11菌株，在5天達(dá)最大(243.85 U/mL)。在10種復(fù)合菌劑中，不同時(shí)間不同菌株復(fù)合所產(chǎn)酶活不同，在2天時(shí)CMCase活性值最大的是15號(hào)菌劑FCY-2+FCW-2，達(dá)290.38 U/mL，是其單菌株的1.48倍和1.98倍；在5天時(shí)CMCase活性值最大的是11號(hào)菌劑FCM-10+FCY-2，達(dá)314.39 U/mL，是其單菌株的1.2倍和1.53倍；在7天時(shí)CMCase活性值最大的是6號(hào)菌劑FCM-1+FCM-10，達(dá)358.11 U/mL，是其單菌株的2.51倍和1.37倍。

表2 纖維素分解菌菌株及其復(fù)合菌劑CMC酶活性

2.6 5株纖維素分解菌菌株鑒定

2.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將5株纖維素分解菌分別于LB培養(yǎng)基與高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上劃線純化，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后觀察。5株高效纖維素分解菌在同一種培養(yǎng)基上外觀形態(tài)差異不大，但在不同培養(yǎng)基之間卻有較大差別（圖3）。2種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落在大小、顏色、形成單菌落的劃線區(qū)、生長(zhǎng)速度不相同。LB培養(yǎng)基上的菌落顏色為檸檬黃，菌落略大(0.2～0.4 cm)，約2天于劃線C區(qū)長(zhǎng)出單菌落，易挑起；而高氏一號(hào)培養(yǎng)基的菌落顏色較淺，偏白，菌落小(0.1～0.2 cm)，約4天于劃線B區(qū)長(zhǎng)出單菌落，C區(qū)菌落數(shù)較少，不易挑起。2種培養(yǎng)基上的菌落都為圓形、濕潤(rùn)、光滑、隆起、有光澤、不透明，有可見基質(zhì)菌絲。5株菌株都為革蘭氏陽性菌，在油鏡下觀察菌體細(xì)短而密集。

圖3 維素分解菌菌株形態(tài)及其革蘭氏染色

2.6.2 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)5株纖維素分解菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上驗(yàn)證，得到1500 bp左右的條帶，送至北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進(jìn)行基因序列的測(cè)定，F(xiàn)CM-1、FCM-10、FCM-11、FCY-2和FCW-2菌株的序列長(zhǎng)度分別為1359、1355、1373、1373、1337、1364 bp。將測(cè)得的序列在NCBI中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Cellulosimicrobium cellulans與Cellulosimicrobiumfunkei16S rDNA序列一致性高達(dá)100%。將測(cè)序序列信息提交Genbank，下載該屬其他序列及所隸屬科相近序列，利用MEGA X基于鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示此5株菌隸屬于Cellulosimicrobium屬，與Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei及Cellulosimicrobiumaquatile，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色結(jié)果，可初步判定該菌隸屬纖維菌屬(Cellulosimicrobium)。

圖4 基于16S rDNA序列同源性纖維素分解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 菌株對(duì)玉米秸稈的降解率測(cè)定

通過5株菌株及其復(fù)合菌劑的纖維素酶活測(cè)定，F(xiàn)CM-10+FCY-2菌劑在時(shí)間（5天）與酶活(314.39 U/mL)綜合優(yōu)于其他處理，所以將FCM-10+FCY-2作為優(yōu)勢(shì)菌劑進(jìn)行玉米秸稈降解實(shí)驗(yàn)，將其單菌劑與未添施菌劑處理設(shè)置為對(duì)照。培養(yǎng)25天后，菌劑處理秸稈相較未添施菌劑處理秸稈來看，顏色變黑、腐爛，秸稈微微塌陷，三角瓶底部也出現(xiàn)了少量液體，其中復(fù)合菌劑處理出現(xiàn)乳白色液體（圖5）。通過對(duì)秸稈降解率測(cè)定可以看出（圖6），菌劑處理降解率高于未添施菌劑處理，經(jīng)過25天降解，復(fù)合菌劑降解率達(dá)53.35%，是對(duì)照的1.87倍，是單菌劑處理的1倍多，F(xiàn)CM-10處理略高于FCY-2處理。表明FCM-10+FCY-2復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用強(qiáng)于單菌劑及未添施菌劑處理，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖5 25天玉米秸稈的降解外觀形態(tài)變化

圖6 25天各菌劑玉米秸稈的降解率

3 討論

研究從貴州典型植煙土壤中篩選獲得5株具有高效降解纖維素的微生物菌劑，通過形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定為Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobiumfunkei，目前cellulosimicrobiumsp.對(duì)于秸稈生物質(zhì)資源降解的研究較少，該菌株具有較高的纖維素酶活，菌株間復(fù)合其纖維素酶活高于單菌株，并對(duì)秸稈表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解率，是有效降解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)品的微生物資源。cellulosimicrobiumsp.作為纖維素與半纖維素分解的微生物，目前僅包括7個(gè)有效發(fā)表的種(www.bacterio.net/chryseobacterium.html)，各菌株可產(chǎn)生多種降解酶，如葡萄糖苷酶、蛋白酶、糖苷水解酶和幾丁質(zhì)酶，廣泛應(yīng)用于纖維素和木聚糖的生物降解和酒精發(fā)酵[17]。Cellulosimicrobiumcellulans通過凝脂多糖(EPS)中的木聚糖體粘附于纖維素表面，從而有效降解纖維素底物[18]。該菌株于多種生境中分離出，可降解苯并(a)芘(BaP)[19]、高集凝乳凝膠[20]、海洋污染物烴等碳?xì)浠衔颷21]等，且具有較高的木糖酶活促進(jìn)了7-木糖紫杉烷向紫杉醇的轉(zhuǎn)化[22]。Cellulosimicrobiumfunkei從人類學(xué)液中分離得到[23]，研究表明該菌株具有較高的Cr(Ⅵ)還原能力，可降低其毒性，進(jìn)行土壤修復(fù)[24]、可降解黃曲霉毒素B1[25]，以保護(hù)作物生長(zhǎng)。Cellulosimicrobiumcellulans和Cellulosimicrobiumfunkei是對(duì)于環(huán)境友好、資源有效利用的優(yōu)質(zhì)微生物資源。

5株來源地不同的纖維素分解菌菌株經(jīng)鑒定具有較高的同源性，但相同培養(yǎng)條件下菌株間酶活存在差異，說明即使同屬相同的種，研究所篩選得到的菌株間仍存在差異，這與劉霄[17]、王元明等[26]的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步區(qū)別還需驗(yàn)證。根據(jù)前人研究成果，Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei是非常重要的微生物資源，將Cellulosimicrobiumcellulans與Cellulosimicrobium funkei制成菌劑添施于秸稈資源還田對(duì)于資源充分利用與修復(fù)損壞土壤具有重要意義。

貴州因其特殊的地形地貌使得植煙土地破碎而不連貫，限制了秸稈還田技術(shù)與規(guī)模的發(fā)展，作為烤煙主要輪作作物秸稈——玉米秸稈，將其有效還田對(duì)于克服烤煙連作或單一輪作障礙具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。就地篩選得到的菌株添施秸稈原位還田具有生態(tài)適應(yīng)性的特點(diǎn)，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究以貴州典型煙區(qū)植煙土壤為高效篩選纖維素分解菌材料，以玉米秸稈粉為唯一碳源，通過初篩、復(fù)篩獲得高效纖維素分解菌5株。其中透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小在2.8～4.2之間，其中以一株湄潭菌株D/d最大，為4.2。通過CMCase活力測(cè)定結(jié)果顯示，菌株間的復(fù)合酶活優(yōu)于單菌株，在5天時(shí)FCM-10+FCY-2 CMCase活性達(dá)314.39 U/mL，是其單菌株的1.2倍和1.53倍，表明5株菌雖都屬于Cellulosimicrobium cellulans與Cellulosimicrobium funkei，且具有較高的同源性(100%)但菌株間仍存在差異，可能是由于生產(chǎn)適宜環(huán)境（溫度等）不同或不能發(fā)酵核糖和糖原等原因[27]。選擇最佳復(fù)合菌劑處理FCM-10+FCY-2制成菌劑降解玉米秸稈，25天時(shí)秸稈外觀出現(xiàn)變化，與對(duì)照相比其顏色變黑、秸稈腐爛，微微塌陷，秸稈降解率達(dá)53.35%，是對(duì)照的1.87倍，是單菌劑處理的1倍多。結(jié)果表明，5株纖維素分解菌具有較好的玉米秸稈降解能力，是適宜于貴州煙區(qū)秸稈還田的潛力菌株。由于5株菌株的高度相似于Cellulosimicrobium cellulans和Cellulosimicrobium funkei都達(dá)100%，系統(tǒng)發(fā)育樹無法精準(zhǔn)區(qū)別，還需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定工作；菌株的降解特性、降解機(jī)理等多方面內(nèi)容也還需作進(jìn)一步的深入研究。