3種植物提取物對稻瘟病菌的抑菌活性及其抑菌機理研究

梁 琪，付歆崴，李云鵬，楊勝甫

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

稻瘟病是由稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)引起的水稻病害，屬于一種世界性稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%～30%[1]。近10年來，稻瘟病在中國局部地區(qū)暴發(fā)流行，實際造成稻谷損失超過50萬t[2]。因此，稻瘟病的防治研究一直是學(xué)界關(guān)注的重點。水稻稻瘟病的防治主要采用以選育高抗、豐產(chǎn)的優(yōu)良水稻品種為核心，結(jié)合改良的農(nóng)業(yè)栽培管理技術(shù)和有效的化學(xué)防治，輔以越冬病原源頭杜絕的綜合防治策略[3]。但是抗病品種存在選育時間長和抗病性易喪失的問題[4]，在應(yīng)用中不能完全滿足需要；而化學(xué)農(nóng)藥易殘留，會對環(huán)境造成污染，對人類機體造成有害影響[5]。所以尋找安全、環(huán)境友好型、經(jīng)濟高效的新型稻瘟病菌抑菌劑已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)中待解決的關(guān)鍵性問題[6]。

張逍遙等[7]認(rèn)為生物農(nóng)藥具有選擇性強，對人畜及非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境中易降解等優(yōu)點。利用生物農(nóng)藥防治稻瘟病是水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要[8]。因此，開發(fā)利用植物源農(nóng)藥，已成為防治稻瘟病的一條重要途徑。Wang等[9]研究表明，千層金(Melaleuca bracteata)提取物對稻瘟病菌的半抑菌濃度(EC50)為33.78 ± 2.35 μg/mL。Rout等[10-11]利用木橘(Aeglemarmelos)提取物合成的殺菌劑對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到81.9%，對葉瘟的田間防效達(dá)到76%～80%。王云峰等[12]分別用100μmol/L和400μmol/L茉莉酸預(yù)先噴霧水稻，6 h后再接種稻瘟病菌株孢子，其誘抗效果分別為16.02%和25.51%；而以100 μmol/L和400 μmol/L茉莉酸制備稻瘟病菌株孢子懸浮液直接噴霧水稻，其誘抗效果分別為21.82%和34.09%。彭玉萌等[13]研究表明，無患子中果皮總皂苷提取物可以強烈抑制稻瘟病病菌的活性。雖然利用植物源農(nóng)藥防治稻瘟病取得了一定的進展，但是對植物源農(nóng)藥抑菌機理方面的研究尚有待加強。

本課題組從大量對人體安全、對環(huán)境友好的植物中，篩選得出幾種具有顯著抑制稻瘟病菌的提取物：黃連、甘草和肉桂。黃連(Coptischinensis)是中國傳統(tǒng)中藥，其抑菌譜較廣，無論是對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌，還是對真菌，均具有良好的抑菌效果[14]。甘草(Glycyrrhizauralensis)是豆科多年生植物，可以藥食兩用，有很好的醫(yī)療保健價值[15]。肉桂(Cinnamomumcassia)作為中國藥食同源的傳統(tǒng)藥物及香料，具有多種藥理作用，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有保護作用，主要表現(xiàn)在擴張血管、抗胃潰瘍、抑菌、抗氧化等方面[16]。但有關(guān)這三種植物提取物對稻瘟病菌的抑菌機理研究尚鮮見報道?；诖?，本試驗以稻瘟病菌為防治對象，在進一步研究黃連、甘草、肉桂3種植物材料抑菌活性的基礎(chǔ)上，通過菌絲掃描電鏡(SEM)觀察、相關(guān)生理指標(biāo)分析，探討其對該病菌菌絲體形態(tài)和生理過程的影響，為開發(fā)防治稻瘟病的新型植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試的3種植物材料為黃連、甘草和肉桂，均購于哈爾濱泰景中西大藥房。

1.1.2 供試菌株 供試病原菌為稻瘟病菌，由黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院實驗室分離鑒定并保存。試驗在黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院實驗室，于2019年9月—2020年12月進行。

1.2 制備方法

1.2.1 植物提取液制備 將植物材料分別粉碎過40目篩，各稱取20 g，加入100 mL濃度為80%的乙醇溶液，超聲波振蕩提取60 min，減壓抽濾，濾液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為浸膏，以50%的乙醇溶液定容至植物材料干樣1 g/mL，為提取物菌絲生長試驗?zāi)敢海灰?%的吐溫80溶液定容至植物材料干樣1 g/mL，為提取物菌絲電鏡觀察試驗?zāi)敢海?℃的冰箱中密封保存。

1.2.2 稻瘟病菌的活化及培養(yǎng)基的制備 按常規(guī)方法制作馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，對保存于試管中的稻瘟病菌進行平板活化培養(yǎng)，菌絲毒力測定使用添加2 g瓊脂及96 mL葡萄糖馬鈴薯汁液的培養(yǎng)基。

1.3 菌絲毒力測定

采用生長速率法進行測定[17]。用50%乙醇作為稀釋溶液，分別配置質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40 mg/mL的各提取物。分別向已制備的96 mL用于毒力測定的培養(yǎng)基中加入4 mL上述質(zhì)量濃度的各提取液，以加入4 mL的50%乙醇為對照，平均倒入4個培養(yǎng)皿中，中間接種直徑0.865 cm的菌餅，于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)120 h時進行菌落直徑測定。每處理選取菌落直徑較接近的3皿計算菌絲生長抑制率。

1.4 菌絲生理指標(biāo)測定

分別制備3種提取物含2%乙醇的EC50濃度提取液，以2%乙醇作為對照，采用硫代巴比妥酸法測定菌絲丙二醛含量[18]；采用外滲電導(dǎo)法測定菌絲細(xì)胞膜透性[19]；采用可見光分光光度法測定菌絲丙酮酸含量[20]；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定菌絲可溶性蛋白含量[21]。

1.5 掃描電鏡觀察

參照潘瀟涵[22]的方法，用5%吐溫80溶液作為稀釋溶液，分別配置質(zhì)量濃度為4.17 mg/mL的黃連提取液、4.48 mg/mL的甘草提取液和5.22 mg/mL的肉桂提取液。分別向已制備的96 mL的培養(yǎng)基中加入4 mL上述質(zhì)量濃度的各提取液，以加入4 mL的5%吐溫80溶液為對照，平均倒入4個培養(yǎng)皿中，中間接種直徑0.865 cm的菌餅，于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)120 h。從培養(yǎng)完成的平板中分別切取2×5 mm的小條，并用小刀切薄瓊脂部分，留下菌絲面，便于后續(xù)觀察。樣品加入2.5%戊二醛固定1.5 h，然后用0.1 mol、pH 7.2的磷酸緩沖液沖洗2次，每次10 min。使用乙醇進行梯度脫水，用100%乙醇：叔丁醇=1:1溶液和純叔丁醇溶液繼續(xù)沖洗，兩者各1次，每次15 min。將樣品放入-20℃冰箱冷藏30 min，放入冷凍干燥箱干燥4 h。對樣品噴金后，將處理好的樣品放入樣品盒中待檢。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)基本處理采用Microsoft Excel軟件；方差分析和Duncan多重比較、毒力回歸方程和EC50計算均采用DPS統(tǒng)計軟件，圖片采用Origin繪圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長抑制作用

由表1可知，3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長均具有較強的抑制活性。在3、4、5、10 mg/mL 4個質(zhì)量濃度下，黃連提取物的菌絲生長抑制率顯著高于甘草提取物和肉桂提取物的菌絲生長抑制率。但在20 mg/mL的質(zhì)量濃度下，3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長抑制率無顯著性差異，菌絲生長均可被完全抑制。

表1 3種提取物的5個質(zhì)量濃度對稻瘟病菌絲生長抑制率 %

由表2可知，3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長毒力如下：黃連EC50＜甘草EC50＜肉桂EC50，黃連提取物在較低濃度下抑菌活性明顯優(yōu)于其他兩種提取物，其EC50值為4.17 mg/mL，甘草提取液次之，EC50值為4.48 mg/mL，肉桂提取液EC50值為5.22 mg/mL。

表2 3種提取物對稻瘟病菌絲生長的毒力

2.2 3種提取物對稻瘟病菌菌絲體內(nèi)丙二醛含量的影響

在細(xì)胞遭遇逆境條件下，一般會發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是產(chǎn)物之一，可將其作為細(xì)胞膜受損的重要指標(biāo)[23]。由圖1可知，經(jīng)3種提取物處理后的稻瘟病菌菌絲，其丙二醛含量均與對照組的菌絲丙二醛含量具有顯著性差異。黃連、甘草和肉桂提取物處理組丙二醛含量分別為2.179 μmol/g、2.162 μmol/g 和2.136 μmol/g，對照組丙二醛含量為2.066 μmol/L。上述結(jié)果表明，3種提取液處理組的稻瘟病菌菌絲丙二醛含量顯著高于對照組，證明3種提取物處理組的細(xì)胞膜發(fā)生了膜質(zhì)過氧化作用。

圖1 3種提取物對稻瘟病菌絲體內(nèi)丙二醛含量的影響

2.3 3種提取物對稻瘟病菌菌絲細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜作為細(xì)胞的屏障，起到一定的防御作用，在細(xì)胞膜遭到破壞時，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)會外滲[24]。由圖2可知，隨著處理時間的延長，3種植物提取物和對照組的菌絲電解質(zhì)滲出率都在升高，前5 min電解質(zhì)滲出率增幅較大，10 min后，電解質(zhì)滲出率增幅開始放緩。經(jīng)3種提取物處理后的菌絲電解質(zhì)滲出率明顯高于對照組的菌絲電解質(zhì)滲出率，當(dāng)處理時間為5 min時，黃連、甘草和肉桂提取物處理組的電解質(zhì)滲出率分別為：83.45%、81.34%和77.78%，對照組電解質(zhì)滲出率為75.81%。當(dāng)處理時間為10 min時，黃連、甘草和肉桂提取物處理組的電解質(zhì)滲出率分別為：84.89%、83.58%和80%，對照組電解質(zhì)滲出率為77.04%。當(dāng)處理時間為80 min時，黃連、甘草和肉桂提取物處理組的電解質(zhì)滲出率分別為：89.93%、88.06%和82.22%，對照組電解質(zhì)滲出率為78.52%。上述結(jié)果表明，3種提取液處理組的稻瘟病菌菌絲電解質(zhì)滲出率高于對照組，證明3種提取物對菌絲細(xì)胞膜透性具有一定的影響，破壞了其半透膜性質(zhì)。

圖2 3種提取物對稻瘟病菌絲細(xì)胞膜通透性的影響

2.4 3種提取物對稻瘟病菌菌絲丙酮酸含量的影響

丙酮酸是細(xì)胞糖代謝途徑中具有關(guān)鍵作用的產(chǎn)物，與菌絲的生命活動息息相關(guān)[25]。由圖3可知，經(jīng)3種提取物處理后的稻瘟病菌菌絲，其丙酮酸含量均與對照組的菌絲丙酮酸含量具有顯著性差異。對照組丙酮酸含量為0.149 mg/g，肉桂、甘草和黃連提取物處理組丙酮酸含量分別為：0.143mg/g、0.140mg/g和0.136mg/g。上述結(jié)果表明，3種提取物處理組的稻瘟病菌菌絲丙酮酸合成受到的抑制作用較強，所以處理組的菌絲丙酮酸含量低于對照組，證明3種提取物干擾了菌絲的正常生命活動。

圖3 3種提取物對稻瘟病菌絲體內(nèi)丙酮酸含量的影響

2.5 3種提取物對稻瘟病菌菌絲可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是細(xì)胞中的生物大分子之一，在病菌受到脅迫的情況下，電解質(zhì)外泄，同時菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白也向外滲出[26]。由圖4可知，經(jīng)3種提取物處理后的稻瘟病菌菌絲，其可溶性蛋白含量均與對照組的菌絲可溶性蛋白含量具有顯著性差異。對照組可溶性蛋白含量為3.13 mg/g，肉桂、甘草和黃連提取物可溶性蛋白含量分別為：1.87 mg/g、1.41 mg/g和0.73 mg/g。上述結(jié)果表明，3種提取液處理組的稻瘟病菌菌絲可溶性蛋白含量顯著低于對照組，原因可能是菌絲可溶性蛋白發(fā)生外滲，也可能是菌絲內(nèi)可溶性蛋白合成遭到抑制。

圖4 3種提取物對稻瘟病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

2.6 3種提取物對稻瘟病菌菌絲形態(tài)的影響

為了進一步探究3種提取物對稻瘟病菌的抑制作用，通過掃描電鏡(SEM)對不同處理下的稻瘟病菌菌絲進行觀察。如圖5所示，在放大2000倍下，對照(a)菌絲表面較光滑飽滿，分布均勻，生長情況健康；黃連提取物處理(b)菌絲表面粗糙、細(xì)胞壁皺縮，分布不再均勻；甘草提取物處理(c)菌絲表面褶皺較多，呈縊縮扭曲，分布不再均勻；肉桂提取物處理(d)菌絲表面出現(xiàn)褶皺，整條菌絲出現(xiàn)多處皺縮，部分菌絲甚至出現(xiàn)斷裂的情況。

圖5 3種提取物對稻瘟病菌絲形態(tài)的影響（掃描電鏡2.00kx）

如圖6所示，在放大10000倍下，對照(a)菌絲較直長舒展，表面平滑飽滿，菌體生長健康。黃連提取物處理(b)菌絲表面極其粗糙，褶皺增多，膨大潰爛，菌絲的絲狀結(jié)構(gòu)崩解，黏連在一起，形成片層狀結(jié)構(gòu)；甘草提取物處理(c)菌絲粗糙呈褶皺狀、干癟變形；肉桂提取物處理(d)菌絲多處皺縮扭曲，整條菌絲被分割成多段。3種提取物對菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)具有不同程度的破壞作用，使稻瘟病菌菌絲發(fā)生原生質(zhì)泄露，從而影響菌體的正常生長。

圖6 3種提取物對稻瘟病菌絲形態(tài)的影響（掃描電鏡10.00 kx）

3 討論與結(jié)論

目前，已有很多學(xué)者開展了利用植物源殺菌劑防治稻瘟病的研究。馬尾松提取物對稻瘟病菌的EC50值為19.38 mg/mL；姜提取物對稻瘟病菌的EC50值為39.78 mg/mL[27]。質(zhì)量濃度200 mg/mL的單葉蔓荊子種子粗提物，在接菌后24 h，對稻瘟病菌菌絲生長的抑菌活性為83.56%[28]。汪金蓮等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著茶多酚濃度的增加，其對稻瘟病菌抑制作用增強，5.00 mg/mL和10.00 mg/mL時抑制率高達(dá)100%。本試驗發(fā)現(xiàn)，黃連、甘草和肉桂提取物在較低濃度下對稻瘟病菌菌絲生長即有較強的抑制作用，3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長的EC50值均低于10 mg/mL。在20 mg/mL濃度下，3種提取物對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率均可達(dá)到100%。

目前，許多關(guān)于利用植物源殺菌劑防治病害的研究還停留在初步篩選抑菌活性階段，而探索植物提取物的抑菌機理可為綠色抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)[30]。本試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)提取物處理的病菌菌絲，丙二醛含量顯著增加，說明病菌細(xì)胞發(fā)生了膜質(zhì)過氧化，電解質(zhì)滲出率在各時間段內(nèi)均高于對照，說明提取物造成病菌細(xì)胞膜一定程度的破壞，可見細(xì)胞膜是黃連、甘草和肉桂提取物作用的主要部位之一；丙酮酸含量顯著降低，可能是提取物對其合成或代謝產(chǎn)生了影響，可見提取物對病菌細(xì)胞合成與代謝活動產(chǎn)生了干擾；可溶性蛋白含量降低，可能是提取物提高了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致菌體可溶性蛋白流失，也可能是可溶性蛋白合成遭到了提取物的抑制；提取物對菌絲超微形態(tài)產(chǎn)生了明顯影響，黃連、甘草和肉桂提取物對稻瘟病菌菌絲的作用程度不同，但大體上均是通過破壞菌體形態(tài)，最后導(dǎo)致菌體畸形、原生質(zhì)泄露。本試驗的研究結(jié)果與郅曉燕等[31]研究地膚子提取物抑制蘋果樹腐爛病菌機理的研究結(jié)果類似，均發(fā)現(xiàn)植物提取物對菌絲體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和透性及物質(zhì)合成與代謝產(chǎn)生了影響和干擾。

3種植物提取物的具體作用靶點和途徑在本次研究中尚未得到解答。前人研究表明，黃連可能通過作用于菌體表面的蛋白，影響蛋白質(zhì)合成，間接抑制核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄，進而阻止細(xì)胞分裂或所需酶的合成及外排泵的功能，從而達(dá)到抑菌的作用[32]；甘草查耳酮能影響微生物的大分子（DNA、RNA以及蛋白質(zhì)）合成[33]；肉桂作用于菌體后，菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成量減少，特別對執(zhí)行特定催化作用酶的合成進行抑制，使體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固、變性，從而實現(xiàn)抑菌、殺菌的效果[34]。3種植物提取物抑菌作用可能與上述因素相關(guān)，其抑制稻瘟病菌生長的具體作用靶點及途徑有待轉(zhuǎn)錄組測序進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃連、甘草和肉桂提取物對稻瘟病菌菌絲生長具有較強的抑制作用，其EC50值分別為4.17 mg/mL、4.48 mg/mL和5.22 mg/mL。抑菌機理研究表明，黃連、甘草和肉桂提取物對稻瘟病菌菌絲細(xì)胞膜具有一定破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量增加，膜質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物丙二醛含量增加；干擾了菌絲細(xì)胞物質(zhì)合成與代謝，使細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和可溶性蛋白含量降低；改變了病原菌超顯微形態(tài)，導(dǎo)致菌絲生長異常。