稗屬植物DNA條形碼研究

袁國(guó)徽，田志慧，李 濤，錢(qián)振官，沈國(guó)輝

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403）

0 引言

稗屬(Echinochloaspp.)為一年生或多年生禾本科草本植物，在全世界大約有50種（包括亞種和變種），分布于熱帶和溫帶地區(qū)[1]。稗屬植物多數(shù)為田間雜草，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛，是世界性惡性雜草之一[2]。中國(guó)稗屬植物記錄有10個(gè)種5個(gè)變種，廣布全國(guó)各地，在農(nóng)田15種嚴(yán)重危害的雜草中居于首位[3]。不同種的稗屬植物對(duì)除草劑敏感性也不相同，但是由于其形態(tài)相似，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中往往將其作為一個(gè)草種進(jìn)行防除[4]。不合理除草劑的使用不僅導(dǎo)致農(nóng)業(yè)資源浪費(fèi)，而且造成稗屬植物的抗藥性逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步加大了防除的難度。植物鑒定分類(lèi)的經(jīng)典方法主要依據(jù)形態(tài)特性，但稗屬植物的形態(tài)性狀具有高度變異性，即同種類(lèi)植物在不同的生境中，其形態(tài)特征如植株高度、穗長(zhǎng)、芒長(zhǎng)等均存在變異，這使得稗屬植物的分類(lèi)鑒定標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一[5]。因此，建立一種分子生物學(xué)分類(lèi)方法作為形態(tài)學(xué)鑒定的補(bǔ)充方法具有重要意義。

植物DNA條形碼(DNA barcoding)是利用標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)或者幾個(gè)DNA序列對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定，該方法不受植物個(gè)體形態(tài)、生長(zhǎng)階段等因素限制[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，高等植物DNA條形碼的研究主要集中在核糖體間隔區(qū)和葉綠體基因組的編碼和非編碼區(qū)域[7]。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ETS是植物DNA條形碼常用的片段[8]。目前，較常見(jiàn)的植物葉綠體DNA條形碼主要有matK、rbcL、rpoC1、rpoB、accD、ndhJ、YCF5、trnH-psbA、trnL-trnF、atpF-atpH、trnD-trnY和psbK-psbI基因等[7]。這些片段可能在不同的類(lèi)群中存在不同的物種分辨率，因此在利用DNA條形碼基因研究物種分類(lèi)時(shí)，要盡可能把葉綠體DNA條形碼和核DNA條形碼一起進(jìn)行研究[9]。

本研究選取葉綠體DNA條形碼psbA、trnL-F、matK，及核DNA條形碼ITS和ETS作為候選序列，比較其對(duì)稗屬植物的鑒別能力，獲得適用于稗屬植物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列，為稗屬植物的分子鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為4種稗屬植物，包括無(wú)芒稗(E.crusgallivar.mitis)、稗(E.crus-gallivar.crus-galli)、長(zhǎng)芒稗(E.caudate)和細(xì)葉旱稗(E.crus-gallivar.praticola)，均于2017年9月采集于上海市水稻田。參照《中國(guó)植物志》[10]，經(jīng)詳細(xì)的物種特征比對(duì)，確定每份材料的物種名稱(chēng)。每個(gè)物種選取3個(gè)個(gè)體，共計(jì)12份樣品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取新鮮植物的葉片部分，每份樣品稱(chēng)取100 mg，使用植物基因組DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 選用5個(gè)候選條形碼序列（psbA、ITS、ETS、trnL-F和matK）的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11-12]，其擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括：1 μL基因組DNA模板，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，25 μL 2×TransTaq-T PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），22 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，各引物退火溫度退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，將含有目的條帶的凝膠進(jìn)行DNA回收。利用pEASY-T1載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接回收DNA序列，然后轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中，涂布于LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落于LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)8～12 h，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 候選條形碼序列擴(kuò)增引物信息

1.2.3 數(shù)據(jù)處理分析 用ClustalX 1.83軟件[13]對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。用MEGA 5.2軟件[14]基于K2P模型分別計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離、序列變異信息，并構(gòu)建鄰接樹(shù)（Neighbor-joining tree，NJ樹(shù)）（空隙采用完全缺失處理，bootstrap進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)獲得分支支持率）。為了量化種間變異與種內(nèi)變異的差異程度，變異分辨率的計(jì)算見(jiàn)公式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選條形碼序列信息和種內(nèi)種間差異分析

對(duì)5個(gè)候選條形碼序列分別進(jìn)行序列分析（表2），發(fā)現(xiàn)psbA序列的長(zhǎng)度最短為337 bp，其次是ETS、ITS和trnL-F序列長(zhǎng)度分別為472 bp、704～705 bp和951～956 bp，matK序列最長(zhǎng)，為1330～1331 bp。ITS和ETS序列的G+C含量介于40%～60%，而psbA、trnL-F和matK序列的G+C含量介于30%～40%。變異位點(diǎn)占比最高的候選條形碼序列為matK，占比最低的候選條形碼序列為ETS。基于K2P模型計(jì)算的遺傳距離，可以看出matK序列的種內(nèi)變異最大，trnL-F、psbA和ITS序列次之，ETS序列最?。桓餍蛄蟹N間變異則以psbA最大，ETS序列最小。各候選條形碼序列變異分辨率的大小次序?yàn)閜sbA＞ITS＞ETS＞trnL-F＞matK。變異分辨率越高說(shuō)明種內(nèi)變異和種間變異的差異越大，區(qū)分能力越強(qiáng)[15]。

表2 候選條形碼序列特征和遺傳變異

2.2 NJ樹(shù)分析

為了直觀評(píng)價(jià)不同候選條形碼序列的鑒定能力，本研究對(duì)5個(gè)序列分別建立了NJ樹(shù)（圖1和圖2）。從核DNA序列ITS構(gòu)建的NJ樹(shù)可以看出（圖1），無(wú)芒稗和稗聚于同一支，支持率為64%，長(zhǎng)芒稗被分為一支，支持率達(dá)到85%；而基于ETS序列構(gòu)建的NJ樹(shù)，長(zhǎng)芒稗被分為一支，支持率為86%。從葉綠體DNA序列psbA、trnL和matK構(gòu)建的NJ樹(shù)可以看出（圖2），長(zhǎng)芒稗均被分為一支，支持率高于90%。由以上數(shù)據(jù)可以得出，所有候選條形碼序列均可以對(duì)長(zhǎng)芒稗進(jìn)行區(qū)分（支持率＞50%），表明長(zhǎng)芒稗在系統(tǒng)發(fā)育中獨(dú)立性相對(duì)較強(qiáng)；ITS序列構(gòu)建的NJ樹(shù)將無(wú)芒稗和稗聚于同一支，相對(duì)于其他序列區(qū)分度更高，更加適用于稗屬植物的鑒別。

圖1 基于核DNA序列ITS和ETS構(gòu)建的NJ樹(shù)

圖2 基于葉綠體DNA序列psbA、trnL-F和matK構(gòu)建的NJ樹(shù)

3 結(jié)論與討論

除了以形態(tài)性狀為主要依據(jù)的傳統(tǒng)分類(lèi)方法以外，分子生物學(xué)技術(shù)在稗屬植物分類(lèi)上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，如RFLP標(biāo)記[16]、RAPD標(biāo)記[17]、SSR標(biāo)記[18]、ISSR標(biāo)記[19]、AFLP標(biāo)記[20]和DNA條形碼[21]等技術(shù)。相比其他分子生物學(xué)技術(shù)，植物DNA條形碼技術(shù)具有極高的可重復(fù)性，并且所需要的引物數(shù)量及投入的人力、物力、時(shí)間顯著減少[6]。

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于在葉綠體基因組和核基因中尋找引物通用性高、測(cè)序質(zhì)量好、物種分辨率高的DNA條形碼候選片段[22]。但到目前為止稗屬植物DNA條形碼篩選的相關(guān)研究報(bào)道較少。Zhang等[11]利用開(kāi)發(fā)的葉綠體DNA條形碼對(duì)稗屬植物進(jìn)行分類(lèi)研究，其中psbA條形碼將200多份稗屬供試材料分成4組。Yamaguchi等[23]利用葉綠體條形碼trnT-L-F將所采稗屬種的9個(gè)種分為5組。葉綠體基因組具有單親遺傳，不發(fā)生基因重組的特點(diǎn)，是DNA條形碼的主要來(lái)源[8]。然而，單靠葉綠體基因組的信息并不足以解決物種鑒定問(wèn)題，葉綠體基因組與核基因組相結(jié)合才能更準(zhǔn)確的鑒定物種[24]，因此本研究所選的DNA條形碼片段既有葉綠體基因片段也有核基因片段。理想的DNA條形碼序列檢測(cè)到的種間遺傳變異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳變異[15]。本研究發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組psbA和核基因組ITS條形碼序列在稗屬植物中種內(nèi)變異和種間變異差異較大，其變異分辨分別為60%和50%。從遺傳變異角度來(lái)看psbA和ITS條形碼對(duì)稗屬植物具有較好鑒別潛能。2011年，中國(guó)植物條形碼研究團(tuán)隊(duì)提出將核基因組ITS作為種子植物的核心條形碼之一[25]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK條形碼序列在稗屬植物種內(nèi)也存在較高變異，與Roy等研究結(jié)果一致[26]。在物種的DNA條形碼分子鑒定中，構(gòu)建NJ樹(shù)是一種常用的條形碼評(píng)估方法。本研究對(duì)5個(gè)候選條形碼序列分別建立了NJ樹(shù)，結(jié)果顯示ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK條形碼序列均可以區(qū)分出長(zhǎng)芒稗，其支持率均大于80%。此外，ITS條形碼序列將無(wú)芒稗和稗聚于同一支，可以區(qū)分出細(xì)葉旱稗。許多研究表明單一DNA條形碼片段難以對(duì)所有植物物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Kress等[27]研究發(fā)現(xiàn)多組合DNA條形碼片段可以顯著提高植物物種鑒定的正確識(shí)別率。Fazekas等[28]提出DNA條形碼的識(shí)別能力與組合數(shù)目相關(guān)。因此，筆者建議將具有較高鑒別潛力的psbA和ITS作為稗屬植物潛在的DNA條形碼片段組合。

從本研究的遺傳變異、構(gòu)建NJ樹(shù)等分析結(jié)果來(lái)看，單個(gè)DNA條形碼序列無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)稗屬植物100%的鑒別。5個(gè)候選條形碼序列中psbA和ITS對(duì)稗屬植物的鑒別潛力最大，而ETS、trnL-F和matK對(duì)稗屬植物的鑒別潛力相對(duì)較差。由于ITS條形碼序列具有區(qū)分細(xì)葉旱稗的能力，綜合考慮將ITS作為稗屬植物鑒定的核心條形碼。DNA條形碼對(duì)物種的鑒定能力除了與選擇的DNA條形碼片段相關(guān)外，還與物種的形成密切有關(guān)[9]。Altop等[17]研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)耕作方式、地理位置、除草劑的使用以及氣候的變化等因素都會(huì)引起稗屬植物在基因型和形態(tài)方面發(fā)生變異。因此，DNA條形碼技術(shù)不能孤立用于稗屬植物的鑒定，還需要與分類(lèi)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合。