慢性腎臟病血管鈣化大鼠模型血清中HIF-1α、β-catenin 的表達(dá)及意義

陳琪琪，譚茹瑜，朱婷婷，張麗玲，歐三桃

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.四川省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 瀘州 646000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率和患病率不斷增加，已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。心血管并發(fā)癥是CKD 患者的首要死因，而血管鈣化是CKD 患者心血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和預(yù)測(cè)因素之一［2］，是導(dǎo)致死于心血管并發(fā)癥的終末期腎臟疾病患者（end stage renal disease，ESRD）增多主要原因之一［3，4］。CKD 血管鈣化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且缺乏敏感的早期生物標(biāo)志物，因此深入探索其機(jī)制，尋找新的血清學(xué)標(biāo)志物十分必要。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路可能是CKD 血 管 鈣 化 發(fā) 生 的 機(jī) 制 之 一［5，6］，且 鈣 化 時(shí) 低 氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)也明顯增加［7，8］，但血管鈣化時(shí)血清HIF-1α、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）水平變化如何，與血管鈣化是否相關(guān)尚不明確。因此本研究旨在探索血管鈣化大鼠血清HIF-1α、β-catenin 變化與血管鈣化的關(guān)系，尋找敏感的血管鈣化早期生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30 只，體重180～270 g，6～8 周齡，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組（CON 組，10 只）和CKD 血管鈣化組（CKD 組，20 只）。

1.2 試劑

腺嘌呤（Sigma 公司，美國(guó)），含磷1.2%的高磷飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，中國(guó)），戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國(guó)），全組織馮庫(kù)薩（Von kossa）鈣染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，中國(guó)），鈣含量測(cè)定試劑盒（C004-2）（南京建成生物工程研究所，中國(guó)），大鼠HIF-1α、β-catenin ELISA 試劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó)），全自動(dòng)生化分析儀（西門(mén)子，德國(guó)），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CKD 大鼠血管鈣化模型建立 CKD 組大鼠給予1.2% 高磷飼料喂養(yǎng)及2.5% 腺嘌呤250 mg/（kg·d）灌胃；對(duì)照組（CON 組）給予普通飼料喂養(yǎng)，并予以等量等頻次生理鹽水灌胃。第6 周末，收集尿液后處死大鼠，留取大鼠血液、腎臟及主動(dòng)脈標(biāo)本。

1.3.2 24 h 尿蛋白、血尿素、肌酐、鈣、磷檢測(cè) 留取24 h 尿檢測(cè)大鼠24 h 尿蛋白量，腹主動(dòng)脈采血并檢測(cè)血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、鈣（Ca）和磷（P），并計(jì)算鈣磷乘積。

1.3.3 主動(dòng)脈Von kossa 染色 GENMED 清理液清洗大鼠新鮮全段主動(dòng)脈后加入GENMED 固定液，在室溫下孵育1 h 后吸去固定液，清理液清洗2次后再次加入GENMED 染色液，孵育1 h 后清洗并加入平衡液，孵育5 min 后再次清洗，觀察并拍照，黑色染色為陽(yáng)性。

1.3.4 腎臟HE 染色 將腎臟包埋成石蠟塊并切片，烤片，二甲苯、乙醇脫蠟脫水，蒸餾水洗5 min，重復(fù)2 次后蘇木素染液染色5 min，沖洗，伊紅染液染色3 min，沖洗，酒精、二甲苯脫水，封片，觀察。

1.3.5 ELISA 法 檢 測(cè) 血 清HIF-1α、β-catenin 水 平標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的稀釋與加樣；溫育，洗滌，重復(fù)5 次，加酶，溫育，洗滌，顯色，終止，測(cè)定OD 值。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，據(jù)樣品OD 值算出的樣品濃度×稀釋倍數(shù)=各樣品的濃度。

1.3.6 主動(dòng)脈鈣含量檢測(cè) 主動(dòng)脈組織經(jīng)液氮研磨、勻漿，留取上清液，配制工作液，按說(shuō)明書(shū)將空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔加樣，混勻，靜置，測(cè)定各孔在波長(zhǎng)610 nm時(shí)的OD值。組織蛋白濃度采用BCA法測(cè)得。組織中鈣含量（mmol/g prot）=（測(cè)定OD 值-空白OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（1 mmol/L）÷樣本蛋白濃度（mmol/g）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎功能及24 h 尿蛋白定量

與CON 組相比，CKD 組大鼠24 h 尿蛋白量、BUN、Scr 均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 大鼠血清鈣（Ca）、磷（P）及鈣磷乘積（Ca×P）

與CON組相比，CKD組大鼠血清磷、鈣磷乘積均較CON組增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），血鈣降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠腎功能、24 h 尿蛋白及生化指標(biāo)水平（±s）Tab 1 The levels of renal function，24 h urine protein and biochemical indexes of rats in two groups（±s）

表1 兩組大鼠腎功能、24 h 尿蛋白及生化指標(biāo)水平（±s）Tab 1 The levels of renal function，24 h urine protein and biochemical indexes of rats in two groups（±s）

組別CON 組CKD 組n 10 20 tP 24 h 尿蛋白（g/24 h）0.00±0.00 0.02±0.00 9.086＜0.05 BUN（mmol/L)5.22±0.67 37.64±7.24 19.849＜0.05 Scr（μmol/L）33.50±2.28 145.45±31.99 15.569＜0.05 Ca（mmol/L）1.97±0.25 1.32±0.26 6.503＜0.05 P（mmol/L）2.56±0.86 6.62±0.86 12.126＜0.05 Ca×P（mmol2/L2）5.19±2.32 8.65±1.77 4.532＜0.05

2.3 大鼠主動(dòng)脈鈣化情況

肉眼觀察見(jiàn)CON 組主動(dòng)脈光滑柔軟，富有彈性；CKD 組主動(dòng)脈彈性差，質(zhì)脆，管壁僵硬，表面凹凸不平，可見(jiàn)明顯的節(jié)段性鈣化結(jié)節(jié)。Von Kossa染色示：CON 組無(wú)黑色染色，CKD 組見(jiàn)黑色物質(zhì)沉積在血管上，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈Von Kossa 染色Fig 1 Von Kossa staining of aorta of rats

2.4 腎臟病理改變

腎組織HE 染色示CON 組腎小球、小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)、形態(tài)未見(jiàn)異常。CKD 組大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球數(shù)量減少，部分萎縮伴囊腔擴(kuò)張，見(jiàn)棕黃色物質(zhì)沉積；腎小管擴(kuò)張伴部分管腔斷裂；腎間質(zhì)呈纖維化改變，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。

2.5 主動(dòng)脈鈣含量檢測(cè)

與CON 組比較，CKD 組大鼠主動(dòng)脈鈣含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.6 血清HIF-1α、β-catenin 表達(dá)水平

與CON 組相比較，CKD 組大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 兩組大鼠主動(dòng)脈鈣含量（±s）Tab 2 The levels of calcium content of aorta of rats in two groups（±s）

表2 兩組大鼠主動(dòng)脈鈣含量（±s）Tab 2 The levels of calcium content of aorta of rats in two groups（±s）

組別CON 組CKD 組n 10 20 tP主動(dòng)脈鈣含量（mmol/g protein）0.14±0.05 0.34±0.15 4.079＜0.05

表3 兩組大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平（pg/mL，±s）Tab 3 The levels of serum HIF-1α and β-catenin of rats in two groups（pg/mL，±s）

表3 兩組大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平（pg/mL，±s）Tab 3 The levels of serum HIF-1α and β-catenin of rats in two groups（pg/mL，±s）

組別CON 組CKD 組n 10 20 t P HIF-1α（pg/mL）0.25±0.04 0.35±0.04 6.9＜0.05 β-catenin（pg/mL）0.24±0.02 0.46±0.01 35.509＜0.05

2.7 相關(guān)性分析

血清P、Ca×P、血清HIF-1α、β-catenin 水平與大鼠主動(dòng)脈鈣含量呈正相關(guān)（P＜0.05），而血Ca 與主動(dòng)脈鈣含量無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 相關(guān)指標(biāo)與主動(dòng)脈鈣含量的相關(guān)性分析Tab 4 Correlation analysis of related indexes and aortic calcium content

圖2 兩組大鼠腎臟HE 染色Fig 2 H & E staining of kidney sections of rats in two groups

3 討論

血管鈣化是CKD 患者心血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致CKD 患者心血管死亡率明顯增加，但血管鈣化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上也缺乏早期識(shí)別血管鈣化的生物標(biāo)志物。本研究通過(guò)采用腺嘌呤灌胃及高磷飼料喂養(yǎng)的方法成功建立CKD 血管鈣化大鼠模型，筆者發(fā)現(xiàn)血清HIF-1α 水平在CKD血管鈣化大鼠組明顯增高，且與主動(dòng)脈鈣含量呈正相關(guān)［9］。HIF-1α 是缺氧狀態(tài)下介導(dǎo)下游基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子［10］，而多種腎臟疾病中普遍存在缺氧的情況，大量研究發(fā)現(xiàn)HIF 系統(tǒng)在多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，比如糖尿病腎?。?1］、急性腎損傷、IgA 腎病等。同時(shí)，HIF-1α 通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、糖代謝途徑、炎癥、氧化應(yīng)激、Notch 信號(hào)通路等多個(gè)機(jī)制參與CKD 的血管鈣化［9］。有研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)有心血管疾病的糖尿病患者血清HIF-1α 水平隨著其冠狀動(dòng)脈鈣化（coronary artery calcification，CAC）程度的加重而明顯增加，提示血清HIF-1α 可能可預(yù)測(cè)CAC 的發(fā)生及其嚴(yán)重程度［12］。一項(xiàng)有關(guān)維持性血液透析(MHD）患者的研究也發(fā)現(xiàn)患者血清中HIF-1α 水平明顯升高，并且與冠狀動(dòng)脈鈣化積分呈正相關(guān)［13］。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)CKD 大鼠主動(dòng)脈上存在HIF-1a-VEGF-Notch 信號(hào)通路的激活。本研究與上述研究結(jié)果一致，這表明HIF-1α 可能可早期反映CKD 血管鈣化的發(fā)生及其嚴(yán)重程度，甚至可能預(yù)測(cè)血管鈣化的進(jìn)展。但是由于HIF 也參與了CKD 腎性貧血、腎臟纖維化、微炎癥狀態(tài)等多種病理狀態(tài)的發(fā)生，且其具體作用目前尚不明確，因此仍需進(jìn)行后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

β-catenin 是Wnt 通路的效應(yīng)分子，可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游一系列靶基因的表達(dá)［14，15］。Wnt/β-catenin 通路與ESRD 患者鈣磷代謝的關(guān)系十分密切，而長(zhǎng)期鈣磷代謝紊亂可繼發(fā)血管鈣化［16］。有研究發(fā)現(xiàn)在高磷、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、β-甘油磷酸、高遷移率族蛋白B1 誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化模型中，β-catenin 的表達(dá)明顯增加，而阻斷β-catenin 的表達(dá) 則 可 以 改 善 甚 至 逆 轉(zhuǎn)VSMCs 的 鈣 化［5，17］。進(jìn) 一步的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路減輕CKD 血管鈣化［18］。有研究人員在ESRD 患者的血管中發(fā)現(xiàn)了Wnt/βcatenin 通路的激活，且β-catenin 的表達(dá)隨血管鈣化的加重而增加［19］。本研究發(fā)現(xiàn)CKD 血管鈣化大鼠血清β-catenin 水平明顯高于CON 組，且與主動(dòng)脈鈣含量呈正相關(guān)，這表明不僅是組織中，血清的βcatenin 水平可能也參與了CKD 血管鈣化的發(fā)生，可能可一定程度上反映血管鈣化的存在，未來(lái)可進(jìn)一步探索血管鈣化患者的血清β-catenin 水平與鈣化的關(guān)系。

綜上，針對(duì)CKD 血管鈣化目前仍缺乏有效的診治手段及早期敏感的血清學(xué)標(biāo)志物，而本研究發(fā)現(xiàn)CKD 血管鈣化大鼠中，其血清HIF-1α、β-catenin 水平明顯增高，且與主動(dòng)脈鈣化程度密切相關(guān)，有望成為預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)CKD 血管鈣化的血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)防治CKD 血管鈣化具有重要意義。