基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究三七治療玻璃體積血的作用機(jī)制

韓夢雨，劉自強(qiáng)，農(nóng)璐琪，王志軍，金 明

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)；2.中日友好醫(yī)院，北京100029）

玻璃體積血（vitreous hemorrhage，VH）是一種常見的導(dǎo)致患者嚴(yán)重失明的眼科疾病，可由多種視網(wǎng)膜血管性疾病或眼外傷引起，給醫(yī)生和患者均帶來挑戰(zhàn)［1］。睫狀體平坦部玻璃體切除術(shù)聯(lián)合（或不聯(lián)合）全視網(wǎng)膜光凝是VH 的首選治療方法，但嚴(yán)重的手術(shù)并發(fā)癥如玻璃體再出血、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎等限制了其應(yīng)用［2］。常作為手術(shù)輔助手段的玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子藥物治療VH 也有應(yīng)用，但目前尚無明確的臨床指南［3］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路為中藥有效成分的研究提供了一條獨(dú)特而創(chuàng)新的途徑，闡明了藥物治療疾病信號途徑的多通道調(diào)控，強(qiáng)調(diào)藥物與疾病靶基因之間的彼此作用及關(guān)聯(lián)，這與中藥多種成分、多靶點(diǎn)及治療疾病的多通道調(diào)控等特性相類似［4，5］。三七，藥性甘、微苦、溫，為“血證要藥”，為中醫(yī)眼科治療VH 等眼底血癥的常用組分藥物。有研究提示單味中藥三七對VH 具有良好的療效，但關(guān)于三七治療VH 的深入藥理作用機(jī)制或信號途徑尚未得到闡明［6，7］。因此，本研究進(jìn)一步探索了三七治療VH的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制，為三七治療VH 的分子途徑等內(nèi)容提供更加全面的認(rèn)識，以期為三七治療VH 的基礎(chǔ)和臨床研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 三七活性成分及其靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫［8］檢索三七的有效成分，根據(jù)藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%及藥物相似性（drug likeness，DL）＞0.18 篩選出主要有效活性成分，并在該數(shù)據(jù)庫中獲取主要有效成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的檢索與篩選

以“vitreous hemorrhage”為檢索詞，Gene Cards（https：//www.genecards.org/）及OMIM（https：//data.omim.org/）數(shù)據(jù)庫被用來檢索獲得VH 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。隨后將VH 相關(guān)靶點(diǎn)與三七有效成分靶點(diǎn)進(jìn)行交集映射，獲得三七治療VH 的潛在靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction ，PPI）網(wǎng)絡(luò)和“三七-活性成分-VH-靶蛋白”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

將上述獲得的VH-三七有效活性成分共同靶點(diǎn)輸入到STRING（https：//string-db.org/）平臺建立三七活性成分靶蛋白和VH 相關(guān)靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖；使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“三七-活性成分-VH-靶蛋白”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 富集分析

為更深入探究三七治療VH 的多生物過程情況，利 用R 軟 件 和DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對三七治療VH 潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）生物過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的代謝通路富集分析［9］。

2 結(jié)果

2.1 三七有效成分篩選

將三七關(guān)鍵詞輸入到TCSMP 數(shù)據(jù)庫后，將三七有效成分經(jīng)OB 及DL 條件進(jìn)行過濾，最終得到8種有效活性成分，見表1。

表1 三七有效成分篩選結(jié)果Tab 1 Active ingredients from panax notoginseng

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

Gene Cards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索后獲取VH 的疾病靶點(diǎn)1 387 個(gè)，將獲取的VH 疾病靶點(diǎn)與三七成分相關(guān)靶點(diǎn)通過軟件取交集后過濾出共同靶蛋白75 個(gè)，韋恩圖見圖1。

圖1 三七與VH 疾病靶點(diǎn)的韋恩圖Fig 1 Venn diagram of notoginseng and VH disease targets

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將VH-三七有效成分共同靶點(diǎn)輸入STRING 平臺進(jìn)而建立靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。根據(jù)Count值篩選出前30 位核心作用靶基因，如圖2 柱狀圖，前5 位分別為蛋白激酶B（AKT1）、CASP3、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9），涉及的信號途徑包括血管生成、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等。

圖2 三七與VH PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Notoginseng and VH PPI network diagram

2.4 “三七-活性成分-VH-靶蛋白”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建三七治療VH 的“三七-活性成分-VH-靶蛋白”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。在該網(wǎng)絡(luò)中，共包含節(jié)點(diǎn)82 個(gè)，其中三七、VH 節(jié)點(diǎn)各1 個(gè)，三七有效成分節(jié)點(diǎn)5 個(gè)（表1 內(nèi)8 個(gè)三七有效成分中，有3 個(gè)成分無對應(yīng)的VH 靶點(diǎn)），三七治療VH 的潛在靶點(diǎn)75 個(gè)，含邊170 條。其中槲皮素（quercetin）、人參皂苷RH2（ginsenoside rh2）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等成分節(jié)點(diǎn)相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)較多，是三七治療VH 的主要有效成分。

圖3 三七治療VH 的“藥物-活性成分-疾病-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “drug?active component?disease?target protein”network of panax notoginseng in the treatment of VH

2.5 GO 功能富集分析

GO 富集結(jié)果顯示，三七治療VH 的靶點(diǎn)影響了包括細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等81 個(gè)生物學(xué)過程，見圖4（前20 位）。

圖4 三七和VH 共同靶蛋白GO 功能富集分析氣泡圖（前20 位）Fig 4 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis of notoginseng and VH co?target protein（top 20）

2.6 KEGG 通路富集分析

本過程篩選出的信號途徑共143 條，主要富集的通路包括有糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號途徑、腫瘤壞死因子信號通路等，見圖5。

圖5 三七和VH 共同靶蛋白KEGG 富集分析（前20 位）Fig 5 KEGG enrichment analysis of notoginseng and VH co?target protein（top 20）

3 討論

VH 是臨床上引發(fā)患者視功能下降甚至致盲的最常見的疾患之一，其病理特點(diǎn)是視網(wǎng)膜缺血、缺氧 和 異 常 新 生 血 管（neovascularization，NV）形成［1，10，11］，炎癥、NV、氧化應(yīng)激等是非外傷性玻璃體積血形成的關(guān)鍵病理因素［12，13］。

本研究確定了三七治療VH 的主要藥物成分是槲 皮 素（quercetin）、人 參 皂 苷RH2（ginsenoside rh2）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等。三七治療VH 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，AKT1、CASP3、VEGF-A、IL-6、MMP-9 等可能是三七發(fā)揮治療作用的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。槲皮素是黃酮類化合物家族黃酮醇亞類的主要代表，具有強(qiáng)大的抗炎、抑制NV 形成、抗氧化應(yīng)激等作用［14-16］。相關(guān)研究也表明β-谷甾醇能發(fā)揮抗炎、抗氧化等作用［17］。人參皂苷RH2 既往研究多集中在抗腫瘤、抗過敏及調(diào)節(jié)免疫等方面，在玻璃體積血相關(guān)研究中涉及甚少［18］。

Akt 是PI3K 的下游效應(yīng)因子，由于Akt 通路在促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡等生物過程中的整合作用，其被稱為生存激酶［19］。caspase-3 水平是檢測細(xì)胞凋亡的可靠標(biāo)志［20］。相關(guān)研究提示槲皮素可通過降低視網(wǎng)膜中caspase-3 水平、增加Bcl-2 的表達(dá)、增強(qiáng)視網(wǎng)膜中Akt 的表達(dá)等發(fā)揮其抗凋亡作用［21］。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix ，ECM）在內(nèi)皮細(xì)胞的移行、黏附、管腔重構(gòu)等異常新生血管的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［4］。VEGF 已被證明是NV 形成的重要介質(zhì)，與糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy ，DR）關(guān)系密切［11］。VEGFA 是目前研究最多的VEGF 家族成員，它被認(rèn)為是介導(dǎo)DR 進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，在增強(qiáng)血管通透性和刺激NV 方面起著關(guān)鍵作用［11］。VEGF-A 還可活化下游PI3K／Akt 途徑發(fā)揮促NV 形成功能［22］。有研究提示槲皮素及其衍生物8-methyl pentamethyl 可通過抑制VEGF 受體2 的活化，從而抑制PI3-K/Akt 活化和Ras 下游級聯(lián)，發(fā)揮抑制NV 的作用［23］。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase ，MMP）是參與ECM 降解和結(jié)締組織重塑的關(guān)鍵蛋白酶，能發(fā)揮調(diào)控組織修復(fù)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等生物學(xué)功能。研究證明MMP-9 通過由Ang2 調(diào)控或定位細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如CASP3）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在DR 進(jìn)展中扮演著一個(gè)重要角色［24］。再者，在高血糖狀態(tài)下，MMP-9 的活性增加，基底膜的降解加快，疏松細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為NV 的形成提供營養(yǎng)和生長空間［25，26］。IL-6可通過調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)、激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3 等途徑參與調(diào)控VH 等眼內(nèi)疾病的炎癥、血管生成等信號途徑［27，28］。槲皮素通過抑制氧化應(yīng)激和阻斷炎性細(xì)胞因子如IL-6 的產(chǎn)生，可以減輕糖尿病患者視網(wǎng)膜的血管滲漏和NV 的形成［29，30］。

生物信息富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七治療VH 作用較大的分子功能包括細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等［10，11，31］。發(fā)揮關(guān)鍵功能的信號有AGE-RAGE、HIF-1、TNF 等；AGE-RAGE 信號通路可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等加重DR 患者血管損傷，AGEs 通過影響ECM，改變細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，進(jìn)而改變靶組織中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，與系膜細(xì)胞、內(nèi) 皮 細(xì) 胞 等 特 異 性 受 體 結(jié) 合［32，33］。HIF-1 信 號途徑中的HIF-1 是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境氧穩(wěn)態(tài)重要的細(xì)胞因子，其在組織如視網(wǎng)膜缺血、缺氧時(shí)，表達(dá)會急劇上調(diào)，從而通過誘導(dǎo)VEGF 等細(xì)胞因子發(fā)揮促血管新生及加劇血管滲漏的作用，導(dǎo)致玻璃體積血等病變產(chǎn)生；巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥是VH 的另一大病理特征，巨噬細(xì)胞可分泌產(chǎn)生TNF 信號途徑最關(guān)鍵的細(xì)胞因子TNF-α，其可激活磷脂酶A2 進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管等組織通透性增加，致使紅細(xì)胞、細(xì)胞因子、血清蛋白等滲漏到組織間隙，引發(fā)玻璃體積血［34］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道三七提取物通過清除羥自由基和超氧自由基，可以防止視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，說明三七具有抗氧化能力［35］。另有研究指出三七可通過抗氧化作用改善微循環(huán)障礙，從而增加血液流動，消除血瘀［36］；三七的抗炎作用可能是其主要成分之一的槲皮素通過干擾MAPKs 和Akt進(jìn)一步減弱NF-κB 信號，從而減輕炎癥［37］。三七也可通過抑制玻璃體中VEGF 等細(xì)胞因子表達(dá)而達(dá)到治療VH 作用［4］，但通過何種信號途徑發(fā)揮上述作用尚未得到解釋，以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果則可能為其帶來相應(yīng)的答案。

本研究探討了三七的有效成分及其治療VH 的可能藥理學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)三七治療VH 可能與抗血管生成、抗炎癥及調(diào)控細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程密切相關(guān)。筆者在這些生物過程的相關(guān)途徑中確定了AKT1、CASP3、VEGF-A、IL-6、MMP-9等五個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。本研究為三七治療VH 的有效成分及靶蛋白的篩選提供了預(yù)測理論依據(jù)，但仍需結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證有效成分及靶標(biāo)的作用機(jī)制。