一株石油降解菌Aquabacterium olei NBRC 110486的基因組完成圖及分析

唐標(biāo)，常江，肖興寧，吳靜，錢鳴蓉，楊華

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

Aquabacterium歸屬于叢毛單胞菌科，伯克氏菌目，β-變形桿菌綱[1]。目前，已經(jīng)有9個(gè)種的報(bào)道，分別是Aquabacteriumcitratiphilum、Aquabacteriumcommune、Aquabacteriumparvum、Aquabacteriumfontiphilum、Aquabacteriumlimnoticum、Aquabacteriumolei、Aquabacteriumtepidiphilum、Aquabacteriumlacunae、Aquabacteriumpictum(https://lpsn.dsmz.de/ genus/aquabacterium)。菌株Aquabacteriumcitratiphilum、Aquabacteriumcommune和Aquabacteriumparvum于2009年首次從德國的飲用水系統(tǒng)中分離[1]，后又分別在2009和2012年從我國臺灣地區(qū)溫泉中分離了A.fontiphilum[2]、A.limnoticum[3]。隨后，2019年在西藏的溫泉沉積物中分離到了A.tepidiphilum[4]。2020年，我國臺灣地區(qū)淡水池中又分離到A.lacunae[5]；另外，在日本多摩河的生物膜中分離出來A.pictum[6]。以上8株菌都從水環(huán)境中分離到，而A.oleiNBRC 110486是2015年從韓國境內(nèi)被石油污染的土壤中分離獲得，并且能夠利用汽油、柴油和煤油作為碳源生長，具有作為生物修復(fù)菌株的潛力[7]。關(guān)于能夠降解石油的細(xì)菌的報(bào)道很多，如Rhodococcus[8]、Pseudomonas[9]等。鏈烷1-單加氧酶AlkB是細(xì)菌降解烷烴的關(guān)鍵酶，也是最普遍存在的類型[10-11]。菌株NBRC 110486是Aquabacterium屬中首個(gè)報(bào)道可以降解石油的菌，但是其完整的基因組沒有測序，序列特征也尚未闡述。

本研究首次報(bào)道了Aquabacterium屬的完整基因組序列，對基因組特征、基因簇預(yù)測和降解基因進(jìn)行了分析，可以作為該屬的參考序列為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)與基因組DNA抽提

A.oleiNBRC 110486購買于國際保藏中心NBRC(NITE biological resource center)。菌株接種至保藏中心推薦的R2A瓊脂培養(yǎng)基(Bacto Yeast Extract 0.5 g；Bacto Proteose Peptone No.3 0.5 g；Bacto Casamino Acids 0.5 g；Glucose 0.5 g；Soluble starch 0.5 g；Sodium pyruvate 0.3 g；K2HPO40.3 g；MgSO4·7H2O 0.05 g；Agar 15 g；Distilled water 1 L；pH 7.2±0.2)，在28 ℃活化培養(yǎng)3 d，隨后轉(zhuǎn)接至R2A液體培養(yǎng)基于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2 d。收集菌體，使用QIAGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。

1.2 基因組測序、組裝及注釋

細(xì)菌基因組DNA提取后，在濃度和純度達(dá)標(biāo)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建20 Kb片段文庫，使用第三代測序儀PacBio RS Ⅱ進(jìn)行高通量測序。原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，采用Celera Assembler軟件進(jìn)行組裝[12]，利用Quiver對組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline[13]對其進(jìn)行基因預(yù)測及功能注釋。

1.3 基因組圈圖繪制和基因簇預(yù)測

基因組注釋圈圖使用CGView server[14]進(jìn)行繪制，使用antiSMASH v5.2[15]對次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

鏈烷1-單加氧酶AlkB使用Long等[16]報(bào)道的序列作為參考，與該基因組進(jìn)行比對，匹配該蛋白。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上BLAST檢索直系同源蛋白，選擇同源性大于30%的蛋白序列，并去除部分冗余蛋白序列。使用MUSCLE軟件進(jìn)行對位比對，使用MEGAX軟件[17]基于最大似然法(Maximum-likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性分析采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組完成圖信息

測序獲得菌株NBRC 110486的完成圖，包括1個(gè)環(huán)形染色體和1個(gè)環(huán)形質(zhì)粒pTB101(圖1)。從染色體的GCskew圖中可以看出，序列能夠清晰的分成2個(gè)部分，說明了組裝結(jié)果的可靠性[18]。染色體全長3 890 087 bp，GC含量為67.33%，共3 402個(gè)蛋白；質(zhì)粒大小為366 221 bp，GC含量為66.91%，325個(gè)蛋白。染色體上的蛋白平均長度為1 056 bp，編碼序列占整個(gè)基因組序列長度的92.3%。染色體上包含4個(gè)連續(xù)的核糖體rRNA操縱子(274 725 bp～297 079 bp)和共計(jì)60個(gè)tRNAs(表1)。

圖1 菌株NBRC 110486的基因組圈

表1 菌株NBRC 110486的完成圖基本信息

2.2 次級代謝基因簇

通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測到2個(gè)可能的次級代謝合成基因簇，第一個(gè)是β-丙內(nèi)酯相關(guān)基因簇mmdA-caiA(494 394 bp～501 271 bp)；另一個(gè)是萜類合成相關(guān)基因簇lon-pssA(2 253 380 bp～2 271 318 bp)，其中HpnD(鯊烯合酶)是該類基因簇的關(guān)鍵合成酶[19]?；虼豰mdA-caiA共5個(gè)保守基因，與MarinobacteroulmenensisDSM 22359和PseudomonasoleovoransE1 205具有同源性。而lon-pssA包含12個(gè)保守基因，與A.communeDSM 11901、SchlegelellathermodepolymeransDSM 15344、PaucibactertoxinivoransDSM 16998、Burkholderialesbacterium JOSHI_001、Pelomonassp. Root662基因組的核酸同源性>75%(圖2)。

圖2 菌株NBRC 110486的基因簇

2.3 AlkB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株NBRC 110486中的AlkB蛋白同源性大于30%的直系同源蛋白進(jìn)行了聚類分析，共使用了143條蛋白序列，獲得67個(gè)明確分類的屬，其中Burkholderia、Pseudomonas、Marinimicrobia等屬中包含的物種較多。系統(tǒng)發(fā)育圖中聚類了3個(gè)較明顯的大分支A、B和C(圖3)。另外，在數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)Aquabacterium屬的AlkB蛋白，但是它們分別聚類在不同的分支上。A.fontiphilum、A.parvum、Aquabacteriumsp. NJ1在分支A上，且與一株Burkholderiales目的細(xì)菌(RTL27502)親緣關(guān)系最近。而Aquabacteriumsp. NBRC 110486、Aquabacteriumsp. KMB7、A.commune和Aquabacteriumsp(WP_125245606.1)位于C分支上，從進(jìn)化的角度上看與假單胞菌屬(Pseudomonas)更接近。結(jié)果表明，AlkB蛋白在細(xì)菌中分布較廣泛，且多樣性高。

圖3 AlkB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 小結(jié)與討論

盡管很多細(xì)菌已經(jīng)有高通量測序數(shù)據(jù)，由于三代測序仍存在較高的成本，能夠獲得完整基因組(完成圖)的細(xì)菌仍占很小的比例。自Aquabacterium屬在1999年被報(bào)道以來，該屬已有9個(gè)種被鑒定，其中6株菌有全基因組序列尚且是草圖，所以此次報(bào)道菌株A.oleiNBRC 110486的完成圖對該屬具有重要的參考價(jià)值。本文僅預(yù)測到2個(gè)可能的基因簇，說明該菌株生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的能力較弱。測序獲得了該屬的第一個(gè)質(zhì)粒pTB101序列，GC含量與染色體類似，說明是長期共進(jìn)化的結(jié)果，水平轉(zhuǎn)移獲得的可能性較小。該質(zhì)粒序列的公布，有利于未來開發(fā)Aquabacterium屬的遺傳操作系統(tǒng)。

AlkB蛋白可作為環(huán)境中檢測石油降解菌的分子標(biāo)記[20]。本研究不僅在菌株NBRC 110486中發(fā)現(xiàn)了AlkB蛋白，還在數(shù)據(jù)庫中挖掘到該屬其他6個(gè)同源蛋白序列，意味著該屬其他菌也有降解石油的潛力，但是需要通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。進(jìn)一步從系統(tǒng)發(fā)育分析中可以看出，它們是屬于2個(gè)不同的來源，這也說明了AlkB蛋白具有較高的分布多樣性[11]。

總的來說，該研究首次報(bào)道了Aquabacterium屬的完整基因組序列，可以為該屬的遺傳改造和石油污染生物修復(fù)功能的后續(xù)研究提供重要依據(jù)。