白及多糖通過調(diào)節(jié)免疫作用抑制結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠腫瘤生長

劉文立 莫海云（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腫瘤科，衡陽 421002）

結(jié)腸癌作為胃腸道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨，目前臨床上治療人結(jié)腸癌的首選方法為手術(shù)切除并輔以化療，但化療會對正常細(xì)胞造成一定的損傷且易于復(fù)發(fā)，部分患者因不能忍受其痛苦過程而放棄治療，且抗腫瘤化療藥物毒副作用大，長期使用易產(chǎn)生耐藥［1-2］。中藥因其療效好、毒副作用少而在腫瘤的治療中體現(xiàn)了獨(dú)特優(yōu)勢。近年來，免疫類中藥多糖因具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤活性顯著和毒副作用小等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床輔助治療［3-4］。白及多糖（bletilla striata polysaccharide，BSP）是中藥白及中分離制備得到的一種具有確定組成和結(jié)構(gòu)的新型葡萄甘露聚糖，有關(guān)其止血、抗胃潰瘍、免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)等藥效已多有報道［5-6］。本研究通過觀察白及多糖對結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用，探討其可能調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為白及多糖的臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。30只SPF級健康BALB/c裸鼠，鼠齡6～7周，體重（20±2）g，由湖北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證編號：SCXK（鄂）2018-0020。白及多糖購于陜西慈緣生物科技有限公司，批號：20180913；香菇多糖購于陜西方晟生物科技有限公司，批號：BZ-201；MTT檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-2、IFN-γELISA試劑盒購于美國R&D公司；APC-CD3e抗體、PE-CD4抗體、PE-CD8a抗體均購自美國BD公司；TLR4、My D88、NF-κB p65抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Science公司；全自動生化分析儀購于Beckman Coulter公司；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司；流式細(xì)胞儀購于美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 右前肢皮下接種CT26細(xì)胞（0.2 ml，1×107個/ml），接種1周左右時，接種處可見平均直徑約5 mm的腫瘤視為造模成功［7］。

1.2.2 動物分組與給藥 將模型裸鼠分為荷瘤模型組（Model）、白及多糖低劑量組［BSP-L，100 mg/(kg·d）］、白及多糖高劑量組［BSP-H，400 mg/（kg·d）］和陽性藥物香菇多糖組［LNT，150 mg/（kg·d）］，每組6只；另取6只健康裸鼠作為對照組（Control）。皮下接種1周后開始灌胃給藥，連續(xù)給藥3周，其中對照組和模型組每天給予與藥物組等量生理鹽水灌胃［8］。

1.2.3 腫瘤生長曲線繪制及抑瘤率計算［9］從接種腫瘤細(xì)胞第1天起，每3 d用游標(biāo)卡尺測量1次腫瘤的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，取瘤稱重計算抑瘤率。其中，腫瘤體積：V=ab2/2；抑瘤率=（1-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量）×100%。

1.2.4 免疫器官指數(shù)計算［10］摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取各組小鼠脾臟和胸腺，稱量質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.5 MTT法測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性［11］收集各組小鼠脾臟組織制成單細(xì)胞懸液，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103個/孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分組處理后每孔加20μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去上清，每孔加入150μl DMSO溶解液，置于搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值（OD490），以O(shè)D490值表示細(xì)胞活力。

1.2.6 ELISA法檢測血清免疫因子水平［12］摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min分離血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中IL-2和IFN-γ含量。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群［11］另取肝素抗凝血20μl，加入180μl紅細(xì)胞裂解液，混勻后，靜置10 min棄去上清液，PBS沖洗2次后重懸白細(xì)胞，加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體混合抗體，避光孵育15 min后上機(jī)檢測，收集數(shù)據(jù)，Cellqeust軟件分析CD4+T細(xì)胞（CD3e+CD4+）、CD8+T細(xì)胞（CD3e+CD8+）百分比，并計算CD4+/CD8+。

1.2.8 Western blot法檢測脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平［12］取各組小鼠脾臟組織稱質(zhì)量后加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000 g離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體和β-actin抗體，4℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。目的蛋白的相對表達(dá)量用目的蛋白與β-actin灰度值比表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 如圖1所示，BSP-H組和LNT組移植瘤生長較Model組緩慢，且接種第22天時BSP-H組和LNT組移植瘤體積顯著小于Model組（P＜0.01），而BSP-L組與Model組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。如表1所示，與Model組相比，BSP-H組和LNT組移植瘤重量顯著降低（P＜0.01），抑瘤率顯著增加（P＜0.01），而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.1 Effects of BSP on tumor growth in tumor-bearing mice

表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice（±s，n=6）

表1 白及多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of BSP on tumor of tumor-bear-ing mice（±s，n=6）

Note：1）P＜0.01，compared with Model group.

Inhibition rate（%）0 4.10 62.801）78.161）Groups Model BSP-L BSP-H LNT Tumor weight（g）2.93±1.10 2.81±0.62 1.09±0.711）0.64±0.871）

2.2 白及多糖對荷瘤小鼠免疫器官的影響 如表2所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著下降（P＜0.01）；與Model組相比，BSPH組和LNT組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著上升（P＜0.01），而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s，n=6，mg/g）Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice（±s，n=6，mg/g）

表2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s，n=6，mg/g）Tab.2 Effect of BSP on Spleen and thymus index in tu-mor-bearing mice（±s，n=6，mg/g）

Note：1）P＜0.01，compared with Control group；2）P＜0.01，compared with Model group.

Thymus index 5.73±0.45 4.01±0.361）4.75±0.17 5.22±0.502）5.27±0.282）Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT Spleen index 8.61±0.60 6.53±0.331）7.23±0.37 7.90±0.182）8.12±0.192）

2.3 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響 如圖2所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著上升（P＜0.05），而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of BSP on lymphocyte activity in spleen of tumor-bearing mice

2.4 白及多糖對荷瘤小鼠血清免疫因子水平的影響 如圖3所示，與Control組相比，Model組小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上調(diào)（P＜0.05），而BSPL組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 白及多糖對荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影響Fig.3 Effects of BSP on IL-2 and IFN-γlevels in serum of tumor-bearing mice

2.5 白及多糖對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 如表3所示，與Control組相比，Model組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著降低（P＜0.05）；與Model組相比，BSP-H組和LNT組小鼠外周血CD4+/CD8+顯著上升（P＜0.05），而BSP-L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice（±s，n=6）

表3 白及多糖對荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+比例的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of BSP on levels of CD4+and CD8+in serum of tumor-bearing mice（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，compared with control group；2）P＜0.05，compared with model group.

CD4+/CD8+1.77±0.27 0.80±0.211）1.00±0.26 1.46±0.192）1.63±0.262）Groups Control Model BSP-L BSP-H LNT CD4+（%）43.43±4.08 25.73±4.821）29.38±2.55 38.73±3.222）40.97±5.272）CD8+（%）24.50±2.91 32.17±3.351）29.33±3.07 26.60±2.872）25.02±2.492）

2.6 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，與Control組相比，Model組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與Model組相比，BSP-H組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88和NFκB p65蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），而BSP-L組和LNT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 白及多糖對荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NFκB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of BSP on protein expressions of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 in spleen tissue of tumor-bear-ing mice

3 討論

由于結(jié)構(gòu)上的多樣性和復(fù)雜性，多糖已成為當(dāng)今最有魅力的信息載體之一。自上世紀(jì)80年代至今，已相繼報道了至少多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)作用等多種生理活性的多糖，其中最重要的活性當(dāng)推免疫調(diào)節(jié)作用。多糖因其增強(qiáng)機(jī)體免疫、輔助抗腫瘤及幾乎沒有毒性等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［13］。本研究結(jié)果顯示，白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路，增強(qiáng)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能，從而起到抑制腫瘤生長的作用。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體免疫功能的下降密切相關(guān)，脾臟和胸腺為重要的免疫器官，是發(fā)生免疫應(yīng)答及合成免疫活性物質(zhì)的重要場所，脾臟和胸腺指數(shù)在一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低，與模型組相比，白及多糖高劑量組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著上升。說明腫瘤的出現(xiàn)引起了機(jī)體免疫器官的萎縮，而白及多糖具有降低模型小鼠脾臟和胸腺損傷的作用，能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。

腫瘤免疫分為免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸3個階段，在免疫清除期，免疫系統(tǒng)可抑制腫瘤生長，起到免疫清除作用，其中IFN-γ、IL-2發(fā)揮重要作用［14］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平顯著下調(diào)，與模型組相比，白及多糖高劑量組的小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著上升。說明白及多糖可通過調(diào)節(jié)血清免疫因子水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

腫瘤可使機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)生異常改變。細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群的改變，CD4+輔助性T細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答；CD8+T細(xì)胞可通過分泌抑制因子抑制CTL細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。兩種作用迥異的T淋巴細(xì)胞借其相互拮抗作用以保持免疫功能的平衡［15］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著下降，外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例降低，CD8+T淋巴細(xì)胞比例升高，CD4+/CD8+比值降低。與模型組相比，白及多糖高劑量組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性顯著上升，外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例上調(diào)，CD8+T淋巴細(xì)胞比例下調(diào)，CD4+/CD8+比值上升。提示白及多糖可增加小鼠體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量，并通過上調(diào)CD4+T細(xì)胞，提高機(jī)體抗腫瘤能力。

TLR4/NF-κB通路是近些年來發(fā)現(xiàn)與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的信號通路，NF-κB信號通路受多種上游信號分子刺激而激活，TLR4是其中之一，其主要表達(dá)在免疫細(xì)胞表面，在介導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)及中藥多糖主導(dǎo)的免疫力提升和細(xì)胞因子釋放中發(fā)揮重要作用［16］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組相比，陽性藥物香菇多糖脾臟組織中相關(guān)蛋白無明顯變化，這主要與香菇多糖的作用機(jī)制有關(guān)，其主要是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力間接發(fā)揮抗腫瘤作用，而白及多糖高劑量組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著上升，提示白及多糖對腫瘤的抑制作用與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，白及多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路，增強(qiáng)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的免疫功能，從而起到抑制腫瘤生長的作用。且其在調(diào)節(jié)免疫功能方面的療效與目前廣泛應(yīng)用于臨床的香菇多糖無明顯差異，說明白及多糖具有很大的開發(fā)利用價值。