銅綠假單胞菌群體感應(yīng)代謝產(chǎn)物通過細(xì)胞表面脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域溶解誘導(dǎo)宿主淋巴細(xì)胞死亡的機(jī)制

祝司霞（攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，攀枝花 617000）

群體感應(yīng)是原核生物基于化學(xué)物質(zhì)的交流機(jī)制［1］?；灸Ｊ较?，社區(qū)中其他成員的胞內(nèi)受體可感應(yīng)出部分個體釋放的自體誘導(dǎo)劑，從而導(dǎo)致集體等基因自體誘導(dǎo)劑合成和同步活動，對于與宿主共生、毒力和社區(qū)生物膜形成具有重要意義［2-3］。銅綠假單胞菌是急性醫(yī)院感染的最常見病原體之一，尤其影響免疫功能低下的個體或重癥監(jiān)護(hù)病房患者［4］。銅綠假單胞菌引起的感染包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、燒傷創(chuàng)面和手術(shù)部位感染及尿路感染，與患者高死亡率（＞30%）密切相關(guān)［5］。銅綠假單胞菌還可引發(fā)囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病或支氣管擴(kuò)張患者慢性呼吸道感染［6］。銅綠假單胞菌具有2個群體感應(yīng)電路：lasR-lasI及RhlR-RhlI，前者采用N-（3-氧代十二烷基）高絲氨酸內(nèi)酯（3OC12 HSL或3oc）作為自動誘導(dǎo)劑，后者采用C4（丁酰基）HSL4［7-8］。3oc是研究最多的群體感應(yīng)自動誘導(dǎo)劑，在哺乳動物宿主中具有重要作用［9］。3oc及類?；滈L度類似物可與膜型和活細(xì)胞雙層膜相互作用［10］。高濃度3oc可破壞質(zhì)膜偶極電位，影響受體配體結(jié)合［11］。但低濃度3oc（5μmol/L）可明顯調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性［12］。本文將探討銅綠假單胞菌群體感應(yīng)代謝產(chǎn)物通過細(xì)胞表面脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域溶解誘導(dǎo)宿主淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級C57BL/6野生型小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心，8～10周齡時，感染銅綠假單胞菌，并進(jìn)行3oc治療。感染前3 d給予無菌水代替3oc治療，另一組持續(xù)給予3oc治療直到實驗結(jié)束。性別、年齡相匹配的常規(guī)定植小鼠作為未經(jīng)3oc治療的對照組。所有實驗程序經(jīng)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)《實驗動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 銅綠假單胞菌培養(yǎng)物上清（碧云天生物試劑公司）；V-FITC和PI（英國Ab?cam公司）；SYBR greenⅠMaster Mix試劑盒（賽默飛世爾）；山羊抗小鼠抗體（美國Invitrogen公司）；兔抗caspase-3、兔抗caspase-9抗體（D35G2，美國Bio Legend公司）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Real-Time PCR System（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌菌株處理MDR銅綠假單胞菌分離株由1例醫(yī)院內(nèi)肺炎患者的呼吸道材料培養(yǎng)而成，感染前，將銅綠假單胞菌置于37℃有氧氣氛中的cetrimid瓊脂（Oxoid）上培養(yǎng)24 h。

1.2.2 AnnexinV/PI凋亡檢測法檢測細(xì)胞凋亡HSL刺激細(xì)胞或不作處理，6 h后收集細(xì)胞，室溫下采用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。銅綠假單胞菌共培養(yǎng)試驗中，分離C57BL/6小鼠骨髓淋巴細(xì)胞，并與WT型、lasI缺陷型或lasR缺陷型銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清共同孵育6 h，顯微鏡下進(jìn)行淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3 免疫共沉淀和Western blot檢測蛋白表達(dá)免疫沉淀4μg山羊抗小鼠抗體與100μl蛋白A/G瓊脂糖室溫孵育2 h，HSL處理脾細(xì)胞（3×106個/ml）或不進(jìn)行治療，收集細(xì)胞，免疫沉淀裂解緩沖液（50 mmol/L HEPES，pH=7.0，150 mmol/L NaCl，1%NP-，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯基甲基磺酰氟，1 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO3和蛋白酶抑制劑混合物）裂解，4℃下加入抗體-珠子混合物反應(yīng)3 h，低速離心（1 000 g，5 min）收集珠子，免疫沉淀裂解緩沖液（添加300 mmol/L NaCl）洗滌4次，最后1次洗滌后將沉淀物采用70μl 2×SDS上樣緩沖液懸浮并煮沸5 min，兔抗caspase-3和兔抗caspase-9抗體（D35G2）檢測caspase-3和caspase-9表達(dá)。HSL處理THP-1細(xì)胞（3×106個/ml）或不做處理。交聯(lián)測定：HSL刺激或不處理從C57BL/6小鼠脾臟或人THP-1細(xì)胞分離的CD4+T細(xì)胞，收集細(xì)胞，室溫下采用10 mmol/L DTSSP交聯(lián)30 min，1 mol/L Tris-HCl（pH=7.5）淬滅15 min，采用來自Bytotime Bio?technology的RIPA緩沖液（50 mmol/L Tris，pH=7.4，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO3和蛋白酶抑制劑混合物）與非還原SDS上樣緩沖液混合，如前所述分離脂筏。將THP-1細(xì)胞在MN緩沖液［25 mmol/L 2-（Nmorpholino）乙磺酸 和150 mmol/L NaCl，pH=6.5］中的1 ml 1%Triton X-100于冰上溶解20 min。將細(xì)胞裂解液用松散的dounce勻漿器勻漿10次，4℃下500 g離心7 min。上清7 000 g離心12 min，4℃下100 000 g離心50 min，記為DIG分?jǐn)?shù)。所有樣品與3×SDS上樣緩沖液混合并煮沸5 min后進(jìn)行Western blot分析。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá) 采用RVana miRNA分離試劑盒提取總RNA，TRIzol試劑分離RNA，采用Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，反應(yīng)條件：42℃60 min，85℃5 min。SYBR greenⅠMaster Mix試劑盒采用7300 Real-Time PCR System進(jìn)行實時PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃變性3 min，45個PCR周期（95℃15 s，60℃20 s），2-ΔΔCt法計算IL-1和IL-6相對表達(dá)，β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件和Graph Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間檢驗采用t檢驗或單因素方差分析，χ檢驗或Fisher精確檢驗計算Ftx表達(dá)和臨床病理學(xué)變量，Kaplan-Meier法建立生存曲線，并采用對數(shù)秩檢驗進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3oc劑量依賴性降低細(xì)胞活性AnnexinV/PI凋亡檢測法檢測T細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，10、20和50μmol/L 3oc可促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表2）。

圖1 AnnexinV/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Annexin V/PI detected cell apoptosis

表2 3oc對T細(xì)胞活化的影響（±s，%）Tab.2 Effect of 3oc on T cell activation（±s，%）

表2 3oc對T細(xì)胞活化的影響（±s，%）Tab.2 Effect of 3oc on T cell activation（±s，%）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P Living cell 82.37±0.15 55.18±0.26 31.15±2.78 15.87±0.13 13.986 0.012

2.2 凋亡相關(guān)蛋白活性檢測 與對照組相比，3oc處理的CD4 T細(xì)胞中caspase-3和caspase-9蛋白活性降低，Cld caspase-3和Cld caspase-9蛋白活性增強(qiáng)（P＜0.05），3oc濃度與caspase-3和caspase-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Cld caspase-3和Cld caspase-9表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05，圖2、表3）。

圖2 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of apoptosis related proteins by Western blot

表3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of apoptosis related proteins（±s）

表3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of apoptosis related proteins（±s）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P caspase-3 1.13±0.12 0.78±0.13 0.47±0.06 0.15±0.03 12.342 0.013 caspase-9 3.37±0.31 2.58±0.15 1.74±0.13 1.05±0.12 25.187 0.017 Cld caspase-3 0.28±0.06 0.54±0.13 1.27±0.18 2.15±0.19 13.946 0.018 Cld caspase-9 0.05±0.01 0.27±0.11 0.68±0.19 1.39±0.16 14.128 0.012

2.3 RT-qPCR檢測炎癥因子IL-1和IL-6 mRNA表達(dá) 與對照組相比，3oc處理的IL-1和IL-6 mRNA表達(dá)增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表4）。

表4 IL-1和IL-6 mRNA表達(dá)（±s）Tab.4 Expressions of IL-1 and IL-6 mRNA（±s）

表4 IL-1和IL-6 mRNA表達(dá)（±s）Tab.4 Expressions of IL-1 and IL-6 mRNA（±s）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P IL-1 1.14±0.13 2.75±0.16 3.27±0.28 3.87±0.32 13.635 0.013 IL-6 0.47±0.13 1.26±0.23 1.89±0.16 2.27±0.32 12.873 0.012

2.4 有序脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的3oc為驗證HSL是否保留于質(zhì)膜中，課題組將H9細(xì)胞（避免凋亡細(xì)胞的干擾）與500μmol/L 3oc HSL或3-oxo-C8HSL或3-oxo-C10 HSL孵育5/10 min，分級，并按不同方式提取和分離3oc HSL或3-oxo-C8或3-oxo-C10 HSL（上清、細(xì)胞溶質(zhì)和膜），發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜級分中，膜和上清中3oc和3-oxo-C10含量更高，細(xì)胞溶質(zhì)中3-oxo-C8 HSL含量更高（P＜0.05，表5）。

表5 有序脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的3oc（±s，n=6）Tab.5 3oc in ordered lipid domain（±s，n=6）

表5 有序脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的3oc（±s，n=6）Tab.5 3oc in ordered lipid domain（±s，n=6）

Groups Supernatant Cytosol Cell membrane F P 3oc 48.62±3.91 5.25±0.14 46.13±3.26 12.287 0.016 3-oxo-C8 HSL 38.75±3.18 40.12±2.87 21.13±2.26 13.254 0.027 3-oxo-C10 HSL 36.21±2.56 12.33±1.72 51.46±3.82 11.175 0.018

2.5 銅綠假單胞菌通過3oc誘導(dǎo)感染宿主細(xì)胞的淋巴細(xì)胞凋亡 為驗證HSL毒力是否可通過自動誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的免疫抑制降低宿主防御能力，課題組采用WT（PAO1）、lasI缺陷型（ΔlasI）和lasR缺陷型（ΔlasR）銅綠假單胞菌培養(yǎng)物上清培養(yǎng)C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示ΔlasI和ΔlasR均可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），可能通過3oc發(fā)揮作用（圖3、表6）。為進(jìn)一步證實結(jié)果，課題組 在C57BL/6小鼠氣管內(nèi)接種PAO1、ΔlasI和ΔlasR突變體，突變體感染小鼠的肺部提取物顯示，銅綠假單胞菌菌落形成單位減少（P＜0.05，表7）。

圖3 細(xì)胞HE染色Fig.3 Cell HE staining

表6 細(xì)胞lasI缺陷和lasR缺陷對細(xì)胞數(shù)的影響（±s，%）Tab.6 Effect of lasi and lasR defections on cells number（±s，%）

表6 細(xì)胞lasI缺陷和lasR缺陷對細(xì)胞數(shù)的影響（±s，%）Tab.6 Effect of lasi and lasR defections on cells number（±s，%）

Groups PAO1 ΔlasI ΔlasR F P Number of cells 8.56±0.13 25.33±2.18 27.26±2.47 9.456 0.011

表7 3oc對T細(xì)胞活化的影響（±s）Tab.7 Effect of 3oc on T cell activation（±s）

表7 3oc對T細(xì)胞活化的影響（±s）Tab.7 Effect of 3oc on T cell activation（±s）

Groups PAO1 ΔlasI ΔlasR F P Colony formation 5.23±0.34 2.82±0.21 2.94±0.26 11.373 0.014

3 討論

獨(dú)立于Tolllike受體和NOD樣受體的傳統(tǒng)先天感應(yīng)機(jī)制已提出幾種基于蛋白的HSL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄因子X-box結(jié)合蛋白1可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的胱天蛋白酶激活［13-14］。另有研究顯示，3oc可作為調(diào)節(jié)劑在一定程度上調(diào)節(jié)PPAR-β/δ和PPAR-γ轉(zhuǎn)錄活性，后者參與上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［15］。本研究提出了一種獨(dú)立于直接蛋白相互作用的機(jī)制，結(jié)果表明，細(xì)菌代謝產(chǎn)物可通過膜干擾改變哺乳動物細(xì)胞表面，誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡。

3oc誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡效果顯著，效果強(qiáng)于TNF-α本身觸發(fā)的凋亡［16］。本研究表明，20μmol/L 3oc可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管3oc濃度在機(jī)體感染部位較高，如在生物膜上可達(dá)數(shù)百μmol/L，但可能形成擴(kuò)散梯度，最終在多數(shù)環(huán)境下測得的濃度都不超過10μmol/L。對氧磷酶2（para-oxonase-2，PON2）是一種攻擊HSL內(nèi)酯環(huán)的內(nèi)酯酶，在部分細(xì)胞中的表達(dá)可顯著降低3oc的促凋亡作用［17］。本研究小鼠模型證實，趨化性吸引至感染部位的淋巴細(xì)胞可能暴露于比多數(shù)臨床測量值高的3oc水平。銅綠假單胞菌中，Las和Rhl群體感應(yīng)可調(diào)節(jié)至少600個細(xì)菌基因［18］。本研究表明，小鼠急性肺部感染模型中，3oc至關(guān)重要，可作為獨(dú)立毒力因子，但其他群體感應(yīng)基因也可能導(dǎo)致銅綠假單胞菌感染。

膜結(jié)構(gòu)域在真核細(xì)胞中具有特異性，其功能發(fā)揮依賴于鞘脂和膽固醇的微型晶體狀聚集［19］。盡管研究已發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)相關(guān)的類胡蘿卜素，但細(xì)菌卻不含膽固醇和大多數(shù)真核固醇。膜結(jié)構(gòu)域在更高的順序上與多種飽和磷脂結(jié)合，動態(tài)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成柵欄樣排列，受長鏈磷脂上黏附的潛在皮質(zhì)細(xì)胞骨架制約［20］。該分區(qū)為高度多樣化的真核表面受體信號傳導(dǎo)提供了通用平臺，使得真核膜對脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域破壞特別敏感。既往粗粒度模型研究多采用由飽和/不飽和磷脂和膽固醇形成的膜中的芳香族和脂肪族疏水分子，該膜在室溫下表現(xiàn)出典型的有序與無序相分離，研究顯示芳族化合物可穩(wěn)定相分離，而脂族結(jié)構(gòu)可通過破壞其邊界促進(jìn)脂質(zhì)域混合，因此，具有12個碳的側(cè)鏈HSL屬于后者，與本研究結(jié)論相符。細(xì)菌群體感應(yīng)自動誘導(dǎo)劑是釋放的小化學(xué)物質(zhì)，用于控制微生物群落行為。N-（3-氧代十二烷?；└呓z氨酸內(nèi)酯是銅綠假單胞菌lasIlasR電路的自誘導(dǎo)物，可引發(fā)淋巴細(xì)胞大量凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)該分子被并入哺乳動物的質(zhì)膜并誘導(dǎo)真核脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域溶解。腫瘤壞死因子受體1因其無配體的自發(fā)三聚作用而進(jìn)入無序脂質(zhì)相，并引發(fā)caspase-3、caspase-9介導(dǎo)的凋亡。銅綠假單胞菌釋放N-（3-氧代十二烷?；└呓z氨酸內(nèi)酯以抑制宿主免疫功能，從而更好地存活。相反，阻斷胱天蛋白酶可顯著降低感染嚴(yán)重程度，揭示微生物與哺乳動物宿主間未知的交流方法，提示可通過攔截群體感應(yīng)信號治療細(xì)菌感染。

本研究認(rèn)為，“群集感應(yīng)”是指細(xì)菌特有的，因受到個體數(shù)量影響而“開啟”或“關(guān)閉”的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。綠膿桿菌中，存在一類稱為“N-oxo-dodecanoyl-L-Ho?moserine lactone（3oc）”的親脂性群集感應(yīng)分子。既往研究發(fā)現(xiàn)，該分子除在細(xì)菌內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性外，還可直接影響宿主信號傳導(dǎo)，主要分為抑制免疫信號及促進(jìn)細(xì)胞凋亡2個方面。3oc的促凋亡作用是其“免疫調(diào)節(jié)”活性的本質(zhì)，3oc通過插入及改變細(xì)胞膜的有序度影響TNFR1的膜運(yùn)動特性，從而促進(jìn)TN?FR1及下游caspase-9與caspase-3激活，引發(fā)細(xì)胞凋亡，而3oc引發(fā)的中性粒細(xì)胞凋亡有助于抑制宿主天然免疫反應(yīng)及促進(jìn)綠膿桿菌體內(nèi)增殖。

綜上所述，3oc可通過直接引發(fā)宿主自身的TN?FR1信號抑制免疫反應(yīng)治療銅綠假單胞菌感染，揭示了直接與宿主細(xì)胞防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)的自動誘導(dǎo)劑的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，即細(xì)菌脂類分子可通過改變膜結(jié)構(gòu)間接導(dǎo)致宿主細(xì)胞受體分子激活，揭示了細(xì)胞膜受體激活的新方式，為調(diào)節(jié)宿主固有免疫力及微生物代謝產(chǎn)物研究提供了重要線索。