二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠的認知功能障礙及血清代謝組學(xué)的調(diào)節(jié)作用①

李文慧 張 杰 劉旭恩（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（河南省精神病醫(yī)院）精神五科，新鄉(xiāng) 453003）

近年，糖尿病和抑郁癥極大加劇了全球疾病負擔(dān)，二者之間的關(guān)系也逐漸引起醫(yī)療人員的興趣［1］。糖尿病患者經(jīng)常會出現(xiàn)心理健康問題，抑郁癥在糖尿病患者中的發(fā)病率是普通人群的兩倍，且與預(yù)后不良相關(guān)［2］。有抑郁癥狀的人發(fā)生糖尿病的風(fēng)險比無抑郁癥狀的人高37%～60%［3］。糖尿病與抑郁癥的合并癥是一項主要的臨床挑戰(zhàn)，因為每種疾病都會因另一種疾病的存在而惡化［4］。糖尿病與抑郁癥共病患者的治療包括常規(guī)藥物治療、心理治療及聯(lián)合治療。目前應(yīng)用的藥物往往僅單獨針對抑郁癥或糖尿病。二氟甲基鳥氨酸是公認的最有效的鳥氨酸脫羧酶特異性抑制劑，可作為鳥氨酸脫羧酶的底物，導(dǎo)致鳥氨酸脫羧酶發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)改變，減少細胞內(nèi)多胺含量［5］。已有研究表明，二氟甲基鳥氨酸抑制2型糖尿病大鼠的心肌細胞凋亡、心肌肥厚及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［6-7］。目前尚無關(guān)于二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥的研究。本文旨在研究二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠的認知功能障礙及血清代謝組學(xué)的調(diào)節(jié)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60只SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，雄性，7周齡，體重（210±15）g，許可證號：SYXK（川）2014-189，置于溫控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h光暗循環(huán)）動物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥物與主要試劑 二氟甲基鳥氨酸（D193）購自美國Sigma-Aldrich，化學(xué)式：C6H12F2N2O2·xHCl·yH2O，分子量：182.17，純度≥98%；蘇木素-伊紅染液（D006-1-1）、5-羥色胺試劑盒（H104）購自南京建成生物工程研究所；5-羥吲哚乙酸試劑盒（HJIR-12628）購自廈門慧嘉生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（C1091）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗單克隆抗體Survivin（ab469）、Ki67（ab15580）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、GLT-1（ab231014）、BDNF（ab226843）、AMPKα1（ab3759）、PGC-1α（ab54481）、GLUT4（ab454）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 參考王宇紅等［8］方法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型，并隨機分為5組：對照組（Control）、模型組（Model）、二氟甲基鳥氨酸低劑量組（DFMO 0.1）、二氟甲基鳥氨酸中劑量組（DFMO 0.25）、二氟甲基鳥氨酸高劑量組（DFMO 0.5）。二氟甲基鳥氨酸低、中、高劑量組分別用0.1、0.25、0.5 mmol/L二氟甲基鳥氨酸灌胃給藥，對照組及模型組灌胃同等體積生理鹽水，灌胃持續(xù)28 d。

1.2.2 HE染色 將腦組織以10%福爾馬林固定并進行石蠟包埋切片厚度為4μm。用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，水洗，鹽酸乙醇分化，水洗藍化，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織并拍照。

1.2.3 TUNEL染色 將腦組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20℃～37℃作用20 min，PBS洗滌3次，加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min后，PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后于熒光顯微鏡下觀測。

1.2.4 RT-PCR TRIzol法提取各組大鼠腦組織中總RNA，Nanodrop分光光度計測定吸光度值（A260/A280），按照試劑盒說明書進行cDNA合成和PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，72℃延長10 min；存儲于4°C條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.5 血清素和5-羥吲哚乙酸含量檢測 試劑盒檢測serotonin（5-HT）和metabolite 5-hydroxyindole?acetic（5-HIAA）含量。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測儀系統(tǒng)檢測，每次進樣20μl，流動相流經(jīng)色譜柱的速度為0.5 ml/min。

1.2.6 血脂指標 采用全自動生化分析儀測定大鼠血脂指標總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.2.7 Western blot將各組大鼠腦組織冰上溶解25 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min后，SDSPAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)3個獨立實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以±s表示，兩兩比較用獨立t檢驗，組間差異采用單因素方差分析檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二氟甲基鳥氨酸改善糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元病理損傷程度 如圖1所示，Con?trol組海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，染色均勻，間隙正常。Model組海馬神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮，呈空泡狀，排列紊亂。DFMO 0.1、0.25、0.5組海馬空泡數(shù)明顯減少，病理損傷程度明顯減輕。

圖1 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元的影響Fig.1 Effects of difluoromethylornithine on hippocampal neurons in diabetic rats with depression

2.2 二氟甲基鳥氨酸促進糖尿病合并抑郁癥大鼠模型細胞凋亡 如圖2所示，細胞核呈現(xiàn)黃褐色為陽性細胞，即凋亡細胞。Model組陽性細胞明顯多于Control組，DFMO劑量組凋亡陽性細胞數(shù)明顯減少，表明DFMO抑制細胞凋亡。

圖2 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of difluoromethornithine on apoptosis of hip-pocampal neurons in diabetic rats with depression

2.3 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax，降低Caspase-3 mRNA水平 如表1所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax顯著降低（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax顯著升高（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影響（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

表1 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影響（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groups Dose（mmol/L）Bcl-2/Bax Survivin mRNA（2-ΔΔCt）1.00 0.13±0.031）0.14±0.061）0.65±0.041）2）0.88±0.082）Caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）1.00 3.02±0.381）2.93±0.421）1.79±0.361）2）1.18±0.292）1.23±0.17 0.15±0.041）0.17±0.061）0.63±0.051）2）0.98±0.072）Control Model DFMO DFMO DFMO--0.10 0.25 0.50

2.4 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白水平 如圖3所示，與Con?trol組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組GLT-1、BDNF蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組GLT-1、BDNF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of difluoromethornithine on GLT-1 and BDNF protein expression levels in diabetic rats with depression

2.5 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型5-HT、5-HIAA含量 如圖4所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組5-HT、5-HIAA含量顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組5-HT、5-HIAA含量顯著升高（P＜0.05）。

圖4 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型5-HT、5-HIAA含量的影響Fig.4 Effects of difluoromethornithine on 5-HT and 5-HI-AA contents in rats with diabetes mellitus compli-cated with depression

2.6 二氟甲基鳥氨酸降低糖尿病合并抑郁癥大鼠模型TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平 如表2所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

HDL-C 1.57±0.11 0.51±0.071）0.56±0.061）1.18±0.321）2）1.66±0.292）Groups Control Model DFMO DFMO DFMO Dose--0.10 0.25 0.50 TC 1.33±0.26 4.84±0.521）4.77±0.631）2.91±0.481）2）1.63±0.322）TG 0.32±0.06 1.61±0.381）1.56±0.241）1.14±0.131）2）0.69±0.092）LDL-C 0.14±0.05 0.82±0.071）0.79±0.061）0.41±0.041）2）0.12±0.052）

2.7 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平 如圖5所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組 相 比，DFMO 0.25、0.5組AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖5 二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠模型MPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白表達水平的影響Fig.5 Effects of difluoromethornithine on protein expres-sion levels of MPKα1，PGC-1αand GLUT4 in dia-betic rats with depression

3 討論

糖尿病是臨床常見的代謝性疾病，其中2型糖尿病占比約90%［9］。由于糖尿病目前無法根治，患者需要長期服藥，給家庭及患者帶來嚴重的經(jīng)濟和心理負擔(dān)，容易使患者產(chǎn)生焦慮抑郁，而抑郁又影響睡眠、情緒及飲食等，導(dǎo)致患者的胰島素抵抗加重，β細胞分泌功能減弱，從而導(dǎo)致血糖升高，使糖尿病惡化［10］。糖尿病合并抑郁癥的常規(guī)治療效果并不理想，且目前尚無專用藥物。CUMS程序是模擬動物抑郁癥的經(jīng)典方法，因為該程序模仿了人類社會常見的壓力事件，其有效性也得到了充分證實［11］。本文采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射鏈脲佐菌素進行糖尿病模型的復(fù)制，再進行CUMS模型的復(fù)制，觀測二氟甲基鳥氨酸對糖尿病合并抑郁癥大鼠的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸可改善糖尿病合并抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷程度，通過降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平改善血脂水平，通過升高Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3 mRNA水平抑制海馬神經(jīng)元細胞凋亡。

糖尿病是認知功能發(fā)生障礙的危險因素［12］。海馬神經(jīng)營養(yǎng)缺失會導(dǎo)致谷氨酸濃度上升，影響認知功能，而谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（GLT-1）可調(diào)控谷氨酸水平，當(dāng)腦內(nèi)谷氨酸含量異常升高時，GLT-1通過主動轉(zhuǎn)運將細胞間隙中過量的谷氨酸轉(zhuǎn)運至膠質(zhì)細胞內(nèi)代謝消除［13］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-de?rived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，通過與相應(yīng)受體絡(luò)氨酸激酶B結(jié)合對胚胎神經(jīng)元的生長、發(fā)育、誘導(dǎo)分化及突觸連接具有調(diào)節(jié)功能［14］。BDNF表達的降低與海馬等認知功能相關(guān)腦區(qū)的結(jié)構(gòu)紊亂及功能連接異常存在一定關(guān)聯(lián)，參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中GLT-1、BDNF蛋白水平明顯降低，在給予二氟甲基鳥氨酸干預(yù)后，海馬中GLT-1、BDNF明顯升高。說明二氟甲基鳥氨酸具有改善糖尿病合并抑郁癥大鼠認知障礙的作用。

5-HT能系統(tǒng)是早發(fā)性抑郁發(fā)病機制中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，“單胺遞質(zhì)假說”認為抑郁的發(fā)生與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT水平低下有關(guān)［16］。5-HIAA是5-HT經(jīng)A型單胺氧化酶作用生成5-羥吲哚乙醛，在醛脫氫酶的催化下生成的無活性酸性代謝終產(chǎn)物，其含量高低也能間接反映5-HT的水平變化。已有研究表明，5-HT能神經(jīng)遞質(zhì)的減退不僅導(dǎo)致情緒障礙的形成，還可影響其他遞質(zhì)的活動誘發(fā)抑郁癥［17］。因此，選擇5-HT作為抗抑郁藥物的治療靶點，通過直接或間接增加突觸中5-HT含量治療抑郁癥［18］。于澤勝等［19］研究發(fā)現(xiàn)柴胡白芍藥對通過逆轉(zhuǎn)CUMS模型大鼠5-HT、5-HIAA水平的降低起抗抑郁作用。Ziziphi spinosae百合粉懸浮液對通過升高5-HT、5-HIAA含量減輕CUMS模型大鼠的抑郁癥狀。本文研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸具有升高5-HT、5-HIAA含量的作用。提示二氟甲基鳥氨酸可改善糖尿病合并抑郁癥大鼠抑郁癥狀。

AMPK被稱為“細胞能量檢測器”，在脂肪組織中，可抑制脂肪分解，降低2型糖尿病患者身體中的高游離脂肪酸循環(huán)，改善糖尿病病情［20］。GLUT4是目前最有潛力的抗糖尿病藥物的作用靶點之一。研究表明，上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的表達有助于緩解2型糖尿病胰島素抵抗，從而治療和預(yù)防2型糖尿?。?1］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated re?ceptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）是介導(dǎo)多種細胞能量代謝和核受體的重要因子，通過激活脂肪酸氧化、糖異生、線粒體呼吸的關(guān)鍵酶參與了脂代謝紊亂、胰島素抵抗、線粒體損傷的形成，PGC-1α可通過特定途徑增加海馬組織中BDNF的表達［22-23］。本文研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸具有升高AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平的作用，說明二氟甲基鳥氨酸通過激活A(yù)MPKα1/PGC-1α/GLUT4通路對大鼠糖尿病合并抑郁癥具有改善作用。

本文研究結(jié)果表明，糖尿病合并抑郁癥大鼠模型中，二氟甲基鳥氨酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元損傷及血脂水平，上調(diào)GLT-1、BDNF蛋白水平及5-HT、5-HIAA含量?？赡苁峭ㄟ^激活A(yù)MPKα1/PGC-1α/GLUT4實現(xiàn)的。本研究闡明了二氟甲基鳥氨酸治療糖尿病和抑郁癥合并癥的潛力。