青蒿琥酯聯(lián)合胰島素對(duì)1型糖尿病合并牙周炎大鼠股骨改建的影響及機(jī)制

周婧婧，農(nóng)曉琳

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530021

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（DOP）是糖尿病常見的并發(fā)癥，是由胰島素分泌相對(duì)或者絕對(duì)不足導(dǎo)致的全身代謝性疾病，表現(xiàn)為骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)破壞、骨密度降低及骨脆性增加。研究認(rèn)為，骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）信號(hào)通路是參與骨改建的重要途徑，是介導(dǎo)骨平衡的重要環(huán)節(jié)［1-2］。慢性牙周炎是糖尿病的并發(fā)癥之一，其導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)釋放白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等炎性因子進(jìn)入全身血液系統(tǒng)，干擾正常的免疫功能，作用于遠(yuǎn)端股骨，進(jìn)一步加快DOP的疾病進(jìn)程［3-4］。青蒿琥酯（ART）是青蒿素的衍生物之一。研究顯示，ART可通過抑制破骨細(xì)胞的生成預(yù)防骨質(zhì)疏松［5］。而胰島素及其下游信號(hào)通路也可以通過介導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育影響骨改建過程［6］。目前關(guān)于ART聯(lián)合胰島素干預(yù)1型糖尿病合并牙周炎的作用效果及其分子機(jī)制尚不明確。2020年5月—2020年10月，我們對(duì)1型糖尿病合并牙周炎大鼠給予ART聯(lián)合胰島素干預(yù)，觀察其對(duì)股骨骨密度、組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及IL-1β、OPG蛋白表達(dá)的影響，旨在為臨床治療DOP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年雄性SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。符合國家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定，按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。將大鼠飼養(yǎng)于SPF清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度40%～70%，溫度18～25℃，12 h/12 h光暗循環(huán)。室內(nèi)通風(fēng)良好，大鼠自主進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料、正常飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 ART注射液（廣西桂林南藥有限公司），重組人胰島素（北京索萊寶科技有限公司），鏈脲佐菌素（STZ，廣州賽國科技有限公司）。牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis，廣東省微生物菌種保藏中心），胰蛋白酶試劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），兔抗鼠IL-1β、OPG多克隆抗體及生物素化山羊抗兔IgG（美國Bioworld公司）。血糖儀（德國羅氏活力型快速血糖儀），LCT-200 micro-CT（日本Aloka公司），Eclipse Ni-E正置熒光顯微鏡（日本Nicon公司）。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 將大鼠隨機(jī)分為模型組32只與正常對(duì)照組8只。模型組參照葉桐江等［7］的方法建立1型糖尿病模型，大鼠禁食20 h后左下腹腔一次性注射1%STZ注射液50 mg/kg，以注射后3 d及7 d隨機(jī)血糖均≥16.7 mmol/L或空腹血糖≥10 mmol/L為造模成功。造模成功后，參照趙戩等［8］的方法建立牙周炎模型。將胰蛋白胨大豆肉湯粉和酵母提取物加入雙蒸水充分溶解，再加入氯化血紅素和維生素K1，配制成牙齦卟啉單胞菌厭氧液體培養(yǎng)液。取牙齦卟啉單胞菌，接種于TSA+5%脫纖維羊血的血瓊脂平板上，4℃、厭氧環(huán)境下保存。使用前將菌株接種至厭氧培養(yǎng)液中，厭氧搖床上搖勻12 h，制成牙齦卟啉單胞菌懸液。以直徑0.2 mm的正畸結(jié)扎絲于雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部環(huán)形結(jié)扎，使用1 mL注射器將牙齦卟啉單胞菌液注射在頰側(cè)及腭側(cè)齦溝底部，每次0.1 mL，每3天注射1次，連續(xù)4周。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎絲在位無脫落并出現(xiàn)明顯的牙齦紅腫，探診深度增加，出現(xiàn)較深的牙周袋，探診易出血。將造模成功的32只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、ART干預(yù)組、INS干預(yù)組、ART+INS干預(yù)組，每組各8只。正常對(duì)照組一次性腹腔注射等量檸檬酸—檸檬酸鈉注射液，后續(xù)牙齒無處理。

1.3 藥物干預(yù) ART干預(yù)組給予ART注射液50 mg/kg灌胃，INS干預(yù)組給予重組人胰島素注射液6 U/kg腹腔注射，ART+INS干預(yù)組給予50 mg/kg ART注射液灌胃及6 U/kg重組人胰島素注射液腹腔注射，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組使用等量生理鹽水灌胃、注射，每天1次，連續(xù)4周。

1.4 標(biāo)本采集與處理 干預(yù)4周后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死。逐層剝離雙側(cè)股骨，取左側(cè)股骨用生理鹽水浸潤(rùn)的濕紗布及錫箔紙包裹，放入液氮中保存，用于檢測(cè)BMD；右側(cè)股骨加入4%多聚甲醛溶液固定24 h，加入15%EDTA脫鈣液中脫鈣28 d，待大頭針可無阻力刺入股骨組織即表示脫鈣過程完成。加入梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)切5μm厚切片，用于后期HE染色和免疫組化染色。

1.5 股骨平均骨密度（BMD）檢測(cè) 取大鼠左側(cè)股骨，加入4%多聚甲醛固定24 h，將近心端修剪成長(zhǎng)度1.5 cm左右，按照股骨的長(zhǎng)軸方向放置并固定，使用micro-CT掃描重建。掃描電壓為低電壓，像素大小為24μm，掃描層厚為24μm，360°環(huán)形掃描。將掃描得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入micro-CT自帶的分析軟件中進(jìn)行等分割解析，計(jì)算BMD。

1.6 骨組織形態(tài)學(xué)觀察 取股骨石蠟切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。正置熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)并拍照。

1.7 骨組織IL-1β、OPG蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化染色法。石蠟切片脫蠟，加入0.1%胰蛋白酶消化液，37℃消化10 min。PBS沖洗，分別加入一抗兔抗鼠IL-1β（1∶200）和OPG（1∶200），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育30 min。PBS沖洗3次，滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片。正置熒光顯微鏡下觀察并采集照片，胞質(zhì)為黃色或棕黃色為陽性。隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像軟件進(jìn)行分析，染色結(jié)果表示為平均光密度值（MOD）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組股骨BMD比較 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、ART干預(yù)組、INS干預(yù)組、ART+INS干預(yù)組股骨BMD分別為（248.02±29.66）、（155.24±26.51）、（189.43±20.78）、（192.67±25.98）、（211.01±24.13）mg/cm3。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、ART干預(yù)組、INS干預(yù)組、ART+INS干預(yù)組股骨BMD均下降（P均<0.05）；與模型對(duì)照組比較，ART干預(yù)組、INS干預(yù)組、ART+INS干預(yù)組股骨BMD均升高（P均<0.05），其中ART+INS組高于其他兩個(gè)干預(yù)組（P均<0.05）。

2.2 各組骨組織形態(tài)學(xué)比較 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量明顯減少，排列不規(guī)律，粗細(xì)不均勻，連續(xù)性破壞，部分區(qū)域出現(xiàn)空腔，鏡下有大量的破骨細(xì)胞，胞質(zhì)嗜堿性，含有多個(gè)緊密堆積的核。與模型對(duì)照組比較，ART干預(yù)組、INS干預(yù)組及ART+INS干預(yù)組中可見骨小梁排列方向、厚度及數(shù)量有改善，新生骨小梁增多，空腔范圍縮小，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，可見骨小梁表面附著有扁平狀、核深染的成骨細(xì)胞。其中，ART+INS干預(yù)組成骨改變較其他兩個(gè)干預(yù)組更明顯，骨小梁數(shù)量顯著增多，排列較為規(guī)律，厚度增加，連續(xù)性較好。

2.3 各組骨組織IL-1β、OPG蛋白表達(dá)比較 IL-1β表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性呈棕色或棕黃色顆粒，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等均可見。OPG表達(dá)于成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞等的胞質(zhì)中，陽性表達(dá)也為黃色或棕黃色顆粒。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組，ART干預(yù)組，INS干預(yù)組及ART+INS干預(yù)組IL-1β蛋白表達(dá)升高、OPG蛋白表達(dá)下降（P<0.05），但ART干預(yù)組、INS干預(yù)組、ART+INS干預(yù)組IL-1β蛋白表達(dá)量均低于模型對(duì)照組（P均<0.05），OPG表達(dá)量均高于模型對(duì)照組（P均<0.05），其中ART+INS干預(yù)組較模型對(duì)照組差異最為顯著（P<0.05）。見表1。

表1 各組股骨組織IL-1β、OPG蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組股骨組織IL-1β、OPG蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。

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3 討論

DOP表現(xiàn)為成骨細(xì)胞數(shù)量減少，抑制正常的類骨質(zhì)形成，骨礦化速度減慢，破骨細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致相對(duì)穩(wěn)定的骨改建平衡被打破，骨形成慢于骨吸收。其在股骨中表現(xiàn)為骨生物力學(xué)性能下降，骨脆性增加，易發(fā)生病理性骨折［11］。牙周病是口腔慢性疾病，當(dāng)其合并糖尿病時(shí)，高血糖促使牙周免疫力下降，出現(xiàn)小血管變性，降低單核細(xì)胞正常的趨化、黏附及吞噬功能，進(jìn)一步加重牙周組織的破壞；聚集在牙周支持組織的細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物可導(dǎo)致炎癥分子合成增加，并大量分泌到血液中，加重骨吸收，最終表現(xiàn)為DOP的臨床癥狀［12-13］。目前臨床上治療DOP主要從控制血糖、減少或緩解并發(fā)癥（如門冬胰島素）與抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成（如降鈣素、阿侖膦酸鈉）兩個(gè)方面入手，其治療效果仍有一定的局限性。胰島素信號(hào)參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的骨形成過程和破骨細(xì)胞的骨吸收過程，通過結(jié)合兩種細(xì)胞表面的胰島素受體，介導(dǎo)其增殖與分化［21］。ART是青蒿素的衍生物，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗纖維化等作用［22］。WEI等［23］報(bào)道，ART可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，預(yù)防骨丟失。本研究采用ART聯(lián)合胰島素干預(yù)1型糖尿病合并牙周炎大鼠，觀察其對(duì)大鼠骨密度、遠(yuǎn)端股骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)及IL-1β、OPG蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)DOP的預(yù)防和治療作用。

IL-1β是已知最高效的骨吸收刺激因素，主要由成骨細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞分泌，通過活化OPG/RANKL/RANK通路，介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖，在牙周結(jié)締組織降解及牙槽骨吸收過程中發(fā)揮重要作用［14-15］。OPG在骨組織中大部分由成骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞分泌而來，競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)發(fā)揮作用，阻斷RANK結(jié)合RANKL，作用于破骨細(xì)胞分化終末階段促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，抑制破骨細(xì)胞正常的分化、融合和成熟，維持骨代謝平衡；其表達(dá)減少時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松［16］。LI等［24］研究顯示，下調(diào)IL-1β等炎性介質(zhì)的合成分泌，可以抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，減弱骨質(zhì)吸收。El-BAZ等［25］研究表明，雨生紅球藻可以通過上調(diào)血清RANKL、下調(diào)血清OPG含量來改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組骨密度下降，股骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞，骨小梁數(shù)量減少，股骨組織中IL-1β蛋白表達(dá)升高、OPG蛋白表達(dá)下降。提示1型糖尿病合并牙周炎可能通過介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK通路增加了遠(yuǎn)端股骨的破骨細(xì)胞活性，加重骨吸收，破壞骨平衡。給予ART、INS、ART聯(lián)合INS干預(yù)后，各組骨密度均增高，骨質(zhì)顯著改善，骨小梁數(shù)量及厚度增加，排列更加規(guī)律，空隙減少，成骨細(xì)胞多見，骨形成大于骨吸收；IL-1β蛋白表達(dá)下降、OPG蛋白表達(dá)升高，且ART聯(lián)合INS組改善最為顯著。分析其作用機(jī)制可能為ART聯(lián)合胰島素通過下調(diào)1型糖尿病合并牙周炎大鼠骨組織中的IL-1β、上調(diào)OPG表達(dá)，介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK通路，阻斷破骨細(xì)胞的分化和成熟，延緩了骨吸收進(jìn)程，達(dá)到改善糖代謝、促進(jìn)骨再生、增強(qiáng)骨結(jié)構(gòu)的效能。

綜上所述，ART聯(lián)合胰島素能夠增加1型糖尿病合并牙周炎大鼠的骨密度，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)；其機(jī)制可能是通過調(diào)控IL-1β、OPG表達(dá)，介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK通路，改善糖代謝，抑制骨吸收，促進(jìn)骨礦化，從而發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松的作用。本研究為防治DOP提供了新思路。