滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的實(shí)驗(yàn)研究△

蔣迪 陳順金 于肖肖 徐志鴻 李剛 黎潤球 毛志強(qiáng) 葉貝華 何錦添

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院耳鼻咽喉科 東莞 523000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院耳鼻喉科 廣州 510280)

鼻咽癌具有獨(dú)特的不均衡性地域分布特點(diǎn)，主要集中在中國南部及南亞地區(qū)[1]。由于鼻咽癌發(fā)生部位較為隱蔽，初發(fā)癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時(shí)已為疾病中、晚期且常伴有轉(zhuǎn)移[2]。常規(guī)放射治療(簡稱放療)聯(lián)合化學(xué)藥物治療(簡稱化療)是鼻咽癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案[3]，而鼻咽癌治療失敗的主要原因?yàn)榫植繌?fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。因此有效預(yù)測鼻咽癌的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能，尋找潛在的分子靶點(diǎn)，對(duì)鼻咽癌的精準(zhǔn)治療及判斷預(yù)后具有重要的意義。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens-2, Trop2)在正常組織不表達(dá)或少量表達(dá)，卻異常高表達(dá)于多種腫瘤，如胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、口腔鱗癌、卵巢癌等。Trop2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，其高表達(dá)與腫瘤患者生存期縮短及不良預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。Trop2已成為腫瘤臨床治療的靶分子之一，抗Trop2相關(guān)位點(diǎn)或通路藥物的臨床應(yīng)用已使許多轉(zhuǎn)移癌患者獲益[5,7]。然而，Trop2在鼻咽癌中的表達(dá)情況及其可能的調(diào)控作用機(jī)制目前報(bào)道較少，還需要進(jìn)一步深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1)組織標(biāo)本。收集41例鼻咽癌和24例對(duì)照鼻咽組織標(biāo)本，均來自東莞市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科。對(duì)照鼻咽組織標(biāo)本來源于鼻咽磁共振成像提示鼻咽增厚，但臨床無相關(guān)癥狀且鼻咽活檢后病理排除腫瘤等相關(guān)病變的患者。該研究在東莞市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和監(jiān)督下開展(倫理注冊號(hào)：PJ201711-020-C1)，并與患者及家屬簽署知情同意書，獲得患者及家屬的知情同意。

2)人源性鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2購自上海中科院細(xì)胞庫。3)主要試劑。Nanog、OCT4、Trop2、U6 qPCR引物(生工生物有限公司，上海)；重組腺病毒載體(吉瑪公司，上海)； SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ試劑(TaKaRa公司，日本)；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒 (銳博生物技術(shù)公司，廣州)，鼠抗人Trop2、鼠抗 人E-cadherin、N-cadherin及GAPDH抗體(Abcam公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石蠟切片免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟后抗原修復(fù)，清除過氧化物，一抗(Trop2兔單克隆抗體)孵育于4 ℃過夜，二抗(鼠抗兔抗體)孵育于37 ℃1 h，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯影，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片后置顯微鏡下觀察，染色結(jié)果判定參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.2.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2以含10%胎牛血清培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行消化、傳代，收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 病毒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后將重組腺病毒載體按感染指數(shù)(MOⅠ)＝50稀釋后加入6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 EdU標(biāo)記 EdU工作液重懸轉(zhuǎn)染后的CNE-2鼻咽癌細(xì)胞，將各組生長良好的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。在5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛溶液中固定，EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.5 MTT法 將轉(zhuǎn)染后的CNE-2細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后加入10 μL 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(5 mg/mL)，置培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h，酶標(biāo)儀于450 nm計(jì)算吸光度(optical density，OD)值。

1.2.6 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) TRⅠzol裂解液提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒制備cDNA。按說明書使用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。引物具體序列如表1所示。

表1 相關(guān)基因的上、下游引物序列

1.2.7 Western印跡 RⅠPA蛋白裂解液試劑盒提取總蛋白，95 ℃變性處理5 min，取20 μg蛋白進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，奶粉封閉后分別加入Trop2一抗(1∶2 000)、E-cadherin一抗(1∶2 000) 、N-cadherin一 抗(1∶2 000)和GAPDH一 抗(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗(1∶5 000)，孵育完成后用TBST(Tris-HC1緩沖鹽溶液+Tween，Tween為一種非離子型去污劑)緩沖液洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。

1.2.8 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)小室鋪好基質(zhì)膠備用，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在上室中加入200 μL含5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含10% 胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液，將小室放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后置顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)小室不鋪基質(zhì)膠，其余步驟與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)記錄均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)與配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。Trop2的表達(dá)與臨床病理特征之間的組間比較采取χ2檢驗(yàn)確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Trop2在鼻咽癌腫瘤組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組織化學(xué)染色顯示Trop2主要分布于鼻咽癌組織的細(xì)胞膜上。鼻咽癌組織標(biāo)本(圖1B)與對(duì)照鼻咽上皮標(biāo)本(圖1A)相比，前者Trop2的表達(dá)明顯高于后者。鼻咽癌組織中的Trop2陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照鼻咽上皮，分別為(60.1±36.7)%和(11.9±18.4)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.998，P＜0.05)，見圖1C。平均OD值分析提示Trop2在鼻咽癌組織中的表達(dá)高于對(duì)照鼻咽上皮，分別為0.261±0.079和0.109±0.160，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝4.339,P＜0.05)，見圖1D。鼻咽癌組織中Trop2的表達(dá)水平與患者年齡及性別無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，與腫瘤病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 Trop2與鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞干性呈正相關(guān) 病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建Trop2低表達(dá)和高表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞，并通過RT-PCR(圖2A)和Western印跡(圖2B)驗(yàn)證，隨后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示Trop2低表達(dá)組Nanog、OCT4mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，Trop2高表達(dá)組Nanog、OCT4mRNA的表達(dá)則明顯高于Trop2對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝4.176，P＜0.05；t＝3.896，P＜0.05)，見圖2C。EdU染色發(fā)現(xiàn)Trop2低表達(dá)組和對(duì)照組的EdU陽性細(xì)胞比例分別為(55.5±3.3)%和(63.6±3.7)%；Trop2高表達(dá)組和對(duì)照組的EdU陽性細(xì)胞比例分別為(67.0±2.7)%和(51.9±4.9)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝6.078，P＜0.05；t＝-7.214，P＜0.05)。 同時(shí)，MTT結(jié)果顯示Trop2低表達(dá)組和對(duì)照組的72 hOD值分別為0.296±0.045和0.616±0.011，Trop2高表達(dá)組和對(duì)照組的72 hOD值分別為0.847±0.042和0.610±0.013(t=19.551,P＜0.05；t=-15.076，P＜0.001)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1 Trop2在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照鼻咽上皮 A.Trop2在對(duì)照鼻咽上皮中的表達(dá)情況(SP法×100)；B.Trop2在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況(SP法×100)；C.陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)；D.OD值檢測。

表2 Trop2在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況[n(%)]

圖2 Trop2與腫瘤細(xì)胞干性有關(guān) A.RT-PCR檢測病毒轉(zhuǎn)染后各組Trop2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B. Western印跡檢測病毒轉(zhuǎn)染后各組Trop2的蛋白表達(dá)水平；C.RT-PCR檢測病毒轉(zhuǎn)染后各組Nanog、OCT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。NC為對(duì)照組。

圖3 Trop2與腫瘤細(xì)胞增殖能力有關(guān) A.EdU染色Trop2過表達(dá)對(duì)照組；B.EdU染色Trop2過表達(dá)組；C.EdU染色Trop2沉默對(duì)照組；D.EdU染色Trop2沉默組；E.EdU實(shí)驗(yàn)的量化計(jì)數(shù)結(jié)果；F.MTT方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對(duì)活性。NC為對(duì)照組。

2.3 Trop2可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 在遷移實(shí)驗(yàn)中，CNE-2細(xì)胞株中Trop2低表達(dá)組、對(duì)照組中每視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)目分別為(101.20±12.47)個(gè)、(157.70±29.31)個(gè)，Trop2高表達(dá)組、對(duì)照組中每視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)目分別為(435.60±33.66)個(gè)、(277.10±20.96)個(gè)，差 異 均具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意義(t＝5.609,P＜0.05；t＝5.609，P＜0.05)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，CNE-2細(xì)胞株中Trop2低表達(dá)組、對(duì)照組中每視野下平均侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為(98.33±8.25)個(gè)、(68.89±12.53)個(gè)，Trop2高 表達(dá)組、對(duì)照組中每視野下平均侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為(274.00±22.58)個(gè)、(153.89±28.34個(gè))，差 異 均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.887,P＜0.05；t＝-9.944，P＜0.05)，詳見圖4。

圖4 Trop2過表達(dá)可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力 A.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Trop2過表達(dá)對(duì)照組；B.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Trop2過表達(dá)組；C.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Trop2沉默對(duì)照組；D.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Trop2沉默組；E.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Trop2過表達(dá)對(duì)照組；F.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Trop2過表達(dá)組；G.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Trop2沉默對(duì)照組；H.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Trop2沉默組；Ⅰ.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的量化計(jì)數(shù)結(jié)果；J.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的量化計(jì)數(shù)結(jié)果。NC為對(duì)照組。

2.4 Trop2可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞-間充質(zhì) 轉(zhuǎn) 化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程 Trop2低表達(dá)組E-cadherin蛋白較對(duì)照組顯著升高，而N-cadherin蛋白較對(duì)照組顯著降低；反之，Trop2高表達(dá)組的E-cadherin蛋白較對(duì)照組顯著降低，而N-cadherin蛋白較對(duì)照組顯著升高，見圖5。

圖5 Trop2可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中上皮組織向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型 Trop2對(duì)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響。NC為對(duì)照組。

3 討論

Trop2是一種腫瘤相關(guān)抗原，又稱為腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子2(tumor-associated calcium signal transducer-2，TACSTD2)[7]。Trop2基因在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等惡性行為。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測41例鼻咽癌及24例對(duì)照鼻咽上皮中Trop2的表達(dá)，結(jié)果顯示鼻咽癌組織中Trop2表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示Trop2可能與鼻咽癌組織相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，Trop2表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期病例組高于Ⅰ ～Ⅱ期病例組，這些結(jié)果表明Trop2與鼻咽癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能在促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。

為研究Trop2基因的生物學(xué)功能，觀察Trop2基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2增殖、侵襲、遷移能力的影響，我們通過病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建Trop2低表達(dá)和高表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株。EdU染色、MTT及RT-PCR證明Trop2可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力和上調(diào)干細(xì)胞基因的表達(dá)。Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Trop2能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本研究還檢測了過表達(dá)Trop2 后鼻咽癌細(xì)胞EMT表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Trop2后能下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，同時(shí)上調(diào)間皮細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin，說明Trop2可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中EMT過程。EMT現(xiàn)象是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理?xiàng)l件下發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[9]。在腫瘤轉(zhuǎn)移起始過程中，腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)微環(huán)境的變化，需要發(fā)生許多表型改變，正常上皮組織的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不利于惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與浸潤，為了獲得運(yùn)動(dòng)能力，腫瘤細(xì)胞通過發(fā)生EMT現(xiàn)象丟失上皮表型，失去其基底細(xì)胞的極性及細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附性，而獲得更易侵襲轉(zhuǎn)移的間質(zhì)細(xì)胞表型。因此EMT是多種上皮源性腫瘤中腫瘤侵襲及早期轉(zhuǎn)移中起決定性作用的過程[10]。研究顯示Trop2可以通過誘導(dǎo)胃癌、膽囊癌、宮頸癌等多種腫瘤中EMT過程從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[11-13]，這與我們在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果是相似的。

此外，EMT現(xiàn)象還能使腫瘤細(xì)胞重編程后具備干細(xì)胞樣特性[14-15]。我們通過EdU染色、MTT、RT-PCR也發(fā)現(xiàn)Trop2可以上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力和干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，提示Trop2與鼻咽癌細(xì)胞的干性細(xì)胞獲得存在直接聯(lián)系。Trop2不僅在胚胎干細(xì)胞增殖特性維持以及器官形成、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[16-17]，還具備調(diào)控成體干細(xì)胞生長的能力，可以促進(jìn)干細(xì)胞和前體細(xì)胞的更新及組織修復(fù)[18-19]。因此我們提出Trop2可能是鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞特征基因的猜想。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中的“種子細(xì)胞”，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有自我更新能力，能在特定的條件下進(jìn)行分化[20-21]。同時(shí)可較長時(shí)間地處于休眠狀態(tài)，通過多種耐藥分子降低對(duì)放療和化療的敏感度，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)[22-23]。目前鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的研究已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，這為認(rèn)識(shí)了解鼻咽癌的本質(zhì)，實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的靶向精準(zhǔn)治療奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究揭示了Trop2在鼻咽癌組織中高表達(dá)，且與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)。Trop2可能是鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的特征基因，其可能通過誘導(dǎo)EMT過程促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這一結(jié)果可以為鼻咽癌的診斷和治療提供新的思路及理論依據(jù)，但Trop2基因作為促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，其在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中的作用及具體機(jī)制尚有待深入研究。