細胞穿透肽Penetratin修飾的眼用脂質(zhì)體的構建與體外評價

徐楠，張姝月，丁雪鷹

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學科，上海200080

眼內(nèi)新生血管性疾病主要位于眼后段，如年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）和糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR），被認為是導致不可逆視力喪失和失明的主要原因［1］。臨床治療眼底新生血管的主要方式是玻璃體腔注射生物藥物，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）受體融合蛋白康柏西普（conbercept，Conb）［2］、阿柏西普［3］等，推薦療程為初始3個月每月給藥1次，之后每3個月給藥1次。玻璃體腔注射是一種侵入性較強的給藥方式，反復注射導致患者依從性差，且容易引發(fā)一些眼部并發(fā)癥，如白內(nèi)障形成、高眼壓、視網(wǎng)膜脫離［4］、玻璃體出血和組織損傷等［5］。因此臨床亟需一種安全有效、使用方便、患者依從性高的給藥方案治療眼底新生血管疾病。

現(xiàn)有相關文獻［6-8］報道，滴眼給藥可作為玻璃體腔注射治療眼底疾病的替代方案。與小分子藥物相比，生物藥物分子量大，親水性強，角膜上皮和淚膜等生物屏障阻礙了藥物滲透，導致到達眼底的藥物濃度很低。改善滴眼所給藥物對眼部屏障的透過性是目前亟需攻克的難題。細胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP）是由幾個或十幾個氨基酸殘基組成的多肽，具有將多種大分子物質(zhì)遞送入細胞的能力，如樹枝狀聚合物［9］、脂質(zhì)體（liposome）［10］、膠束［11］和蛋白質(zhì)［12］等。Penetratin是一種源于果蠅觸角基因同源結構域的CPP，可通過滴眼給藥到達眼后部視網(wǎng)膜，其角膜穿透能力是對照肽的87.5倍，是其他CPP的16～31倍［13］，在眼部滲透性和生物相容性方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

脂質(zhì)體由包裹在水相周圍的磷脂雙分子層組成，成分與細胞膜相似，可增強藥物的角膜滲透能力。Cheng等［14］研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖包衣脂質(zhì)體滴眼液可有效穿透角膜治療視網(wǎng)膜黃斑水腫，Lai等［15］發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體滴眼給藥后可有效改善大鼠光氧化性視網(wǎng)膜損傷。脂質(zhì)體載藥性能優(yōu)良、生物相容性高、易于表面修飾、臨床轉(zhuǎn)化性強，是一種很有前景的眼部藥物載體。目前尚未見Penetratin修飾的脂質(zhì)體（Penetratin-modified liposome，Pen-Lip）滴眼給藥治療眼后部疾病的報道。本研究構建了一種眼用Pen-Lip，并對其理化性質(zhì)和體外行為進行了表征及評價，以期實現(xiàn)非侵入性治療眼底新生血管疾病。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

Penetratin［（HS-）CRQIKIWFQNRRMKWKK］購自上海強耀生物科技有限公司，蛋黃卵磷脂（egg phosphatidylcholine，ePC）、膽固醇（cholesterol，chol）、二硬脂?；字Ｒ掖及?N-馬來酰亞胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-Mal）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）購自上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司，Conb眼用注射液購自成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、非必需氨基酸（non-essential amino acidssolution，NEAA）購自美國Gibco公司，人IgG ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、尼羅紅（Nile red，Nr）染料購自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海大研儀器有限公司，Zetasizer ZS90型納米粒度電位儀購自英國Malvern公司，JEM-2010型 透 射 電 子 顯 微 鏡（transmission electron microscope，TEM）購自日本JEOL公司，低溫高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，DMIL熒光顯微鏡購自德國Leica公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，超凈工作臺購自淀山湖凈化設備儀器廠，MS-H-PRO磁力攪拌器購自大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，MULTISKANMK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

人源角膜上皮細胞（human corneal epithelial cell，HCEC）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（human retinal pigment epithelium，ARPE-19）由上海市第一人民醫(yī)院孫曉東課題組饋贈。

HCEC在含有15%FBS、1%雙抗、1%NEAA的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，ARPE-19在含有10%FBS、1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均置于條件為37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。定期在顯微鏡下觀察細胞生長情況。待細胞生長融合度達80%時進行傳代，傳至第3～8代時進行細胞實驗。

1.3 DSPE-PEG2000-Pen共聚物的合成

DSPE-PEG2000-Pen由DSPE-PEG2000-Mal的馬來酰亞胺基團和Penetratin半胱氨酸殘基上的巰基通過1，4加成反應所得［16］。將DSPE-PEG2000-Mal和Penetratin溶解于氯仿中，滴加三乙胺作為催化劑，輕輕振搖。該混合溶液在充氮條件下于室溫避光反應24 h，然后進行過濾，所得濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)得到固體結晶。固體結晶用氯仿重新溶解后過濾，再次通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)進行純化操作。產(chǎn)物于-20℃下儲存直至使用。合成原理如圖1所示，堿催化劑奪取半胱氨酸巰基上的活潑氫，硫負離子進攻β不飽和酮的β位，經(jīng)1，4共軛加成和酮式烯醇式互變異構過程，定量地生成C-S-C偶聯(lián)產(chǎn)物。

圖1 DSPE-PEG2000-Pen共聚物的合成示意圖Fig 1 Schematic diagram of synthesis of copolymer DSPE-PEG2000-Pen

1.4 脂質(zhì)體的制備

空白脂質(zhì)體（Lip）通過薄膜分散法制備［17］。稱取10.0 mg ePC、2.5 mg Chol、3.0 mg DSPE-PEG2000溶解于裝有二氯甲烷和甲醇（體積比為2∶1）混合溶液的試管里，并轉(zhuǎn)移至茄型瓶中；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃條件下進行減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，瓶壁上可形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜；繼續(xù)真空干燥2 h除去殘余的有機溶劑。將10 mL PBS溶液（0.1 mmol/L，pH 7.4）加入茄型瓶中，快速振蕩，使PBS溶液與脂質(zhì)薄膜發(fā)生水合作用；然后在冰上進行水浴超聲使脂質(zhì)薄膜從瓶壁上完全脫落，繼續(xù)避光攪拌1h；得到的乳白色液體先后通過0.45μm、0.22μm微孔濾膜進行過濾，重復3次后獲得粒徑合適的Lip，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

Pen-Lip制備方法同上，區(qū)別在于將DSPE-PEG2000替換 為DSPE-PEG2000-Pen。Lip/GFP、Pen-Lip/GFP、Lip/Conb、Pen-Lip/Conb的制備方法同上，區(qū)別在于將水合介質(zhì)PBS溶液替換為含GFP或Conb的PBS溶液。Nr標記的脂質(zhì)體制備方法同上，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)之前加入適量Nr于有機試劑中，重復后續(xù)步驟即得到Lip/Nr、Pen-Lip/Nr。上述脂質(zhì)體制備完成后均于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Penetratin修飾比例的確定

通過細胞攝取實驗來確定修飾脂質(zhì)體的最佳Penetratin修飾比例［18］。將HCEC按2×105/孔的密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用PBS潤洗2遍，將1%、3%、5%Pen（DSPE-PEG2000-Pen濃度分別1%、3%、5%）修飾的Pen-Lip/Nr溶液加入12孔板中。細胞與Pen-Lip/Nr孵育4 h后，用含1 000 IU/mL肝素的PBS于冰上洗滌3次，去除細胞外結合的Pen-Lip/Nr，將細胞浸泡在每孔1 mL的PBS中，并立即使用倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)觀察細胞對于Pen-Lip/Nr的攝取情況。用Image J軟件對平均熒光強度進行半定量分析。

1.6 脂質(zhì)體的表征檢測

取100μL新鮮制備的Lip、Pen-Lip溶液，稀釋10倍后放入測量池中，用動態(tài)光散射粒徑分析儀分析測定平均粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）。

用TEM觀察Pen-Lip的形態(tài)。鑷子小心夾著覆有碳支持膜的銅網(wǎng)，用吸管吸取新鮮制備的Pen-Lip溶液，滴1滴樣品至銅網(wǎng)上；滴液后靜置數(shù)分鐘，無殘留液體時滴加負染色液進行染色；吸去多余染料，待銅網(wǎng)自然干燥后即可置入電鏡中觀察，設加速電壓為75 kV，觀察并拍照。

采用離心法［17］間接測定包封率和載藥量。將新鮮制備的Lip/Conb、Pen-Lip/Conb進行離心（4℃，11 250×g，20 min），上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，通過ELISA試劑盒來測定上清液中Conb的濃度。根據(jù)以下公式計算包封率和載藥量：

1.7 穩(wěn)定性研究

為了考察脂質(zhì)體在常規(guī)條件和生理條件下的穩(wěn)定性，分別以PBS、含50%FBS的PBS為介質(zhì)并測定不同時間點Lip、Pen-Lip的粒徑大小。將新鮮制備的Lip、Pen-Lip分散在PBS溶液或含50%FBS的PBS溶液中，在預定的時間點（0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h）取樣測定脂質(zhì)體的平均粒徑，并在48 h后取樣拍攝電鏡圖。

1.8 細胞毒性考察

采用CCK-8法對Lip、Pen-Lip的細胞毒性進行考察。將HCEC、ARPE-19細胞按5×103/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后將Lip、Pen-Lip用無血清培養(yǎng)基稀釋成濃度為15、30、60、120、250、500μg/mL的溶液加入96孔板中。孵育24 h后用PBS洗滌3次，加入100μL含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值并計算各濃度處理下的細胞存活率。

1.9 細胞對脂質(zhì)體攝取情況的檢測

在24孔板中預先鋪上無菌的圓形蓋玻片，將ARPE-19細胞按5×104/孔的密度接種在蓋玻片上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。用PBS潤洗2遍后，將含有Nr染料、Lip/Nr或Pen-Lip/Nr的無血清培養(yǎng)基加入24孔板中。37℃孵育3 h后，用含1 000 IU/mL肝素的PBS于冰上洗滌3次，去除細胞外結合的Nr染料、Lip/Nr或Pen-Lip/Nr。用預冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次。吸取10μL含DNA結合染料DAPI的抗熒光淬滅封片液滴在載玻片上，小心取出蓋玻片，將有細胞的一面貼在滴有封片液的載玻片上，避光放置30 min。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞對于脂質(zhì)體的攝取情況。

1.10 離體滲透性和組織毒性檢測

使用擴散池裝置測定Pen-Lip/GFP通過離體兔角膜的滲透性。擴散孔的內(nèi)徑為10 mm，擴散面積為0.785 cm2。通過耳緣靜脈注射致死劑量的戊巴比妥鈉處死家兔，摘除眼球，小心地將角膜（連同周圍約2 mm寬度的鞏膜）從眼球中取出，用PBS輕輕沖洗。將角膜水平放置在供體室與受體室之間，使角膜上皮表面面向供體溶液，用夾子固定。擴散池中的溶液通過循環(huán)加熱系統(tǒng)預熱并保持在34℃，磁力攪拌速度為100 r/min。供體液分別為3 mL GFP、Lip/GFP、Pen-Lip/GFP（GFP濃度為5 mg/mL），受體液為等體積PBS溶液，排盡氣泡使角膜組織與受體液充分接觸。在4 h內(nèi)，每隔0.5 h從受體室中吸取100μL樣品，然后立即補充等量的PBS。使用酶標儀檢測提取樣品中GFP的濃度，并使用如下公式計算相應的表觀滲透系數(shù)Papp（cm/s）：

其中ΔQ/Δt是GFP濃度隨時間的變化，由滲透曲線線性部分的斜率表示；c0表示GFP的初始濃度；A表示擴散裝置的擴散面積；3 600為換算因子。

使用相同裝置和方法檢測Pen-Lip/Conb對離體角膜的滲透性，供體液分別為3 mL Conb、Lip/Conb、Pen-Lip/Conb（Conb濃度均為1 mg/mL），受體液為等體積PBS溶液，用ELISA試劑盒檢測提取樣品中Conb的濃度。在滲透性實驗后通過角膜水合值（hydration value，ΔH）初步評價脂質(zhì)體對角膜組織的毒性。從擴散裝置中取出角膜，將周圍的鞏膜組織去除，精確稱量每個角膜組織，質(zhì)量記為m0，在65℃下烘干48 h后再次稱量，質(zhì)量記為m1，并按照如下公式計算水合值：

1.11 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 7進行統(tǒng)計學分析。定量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Penetratin修飾的最佳比例

為了確定脂質(zhì)體修飾所需的最佳Penetratin比例，通過細胞攝取實驗評估了不同比例Penetratin修飾的脂質(zhì)體被細胞攝取效率，用平均熒光強度大小來表示攝取效率高低。如圖2所示，3組的平均熒光強度分別為27.57±1.28、35.53±1.12、27.34±0.77，當用3%Pen修 飾脂質(zhì)體時，平均熒光強度最高，與1%Pen、5%Pen修飾組差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），表明該比例修飾組被細胞攝取效率最高。后續(xù)制備時均使用3%Pen修飾脂質(zhì)體。

圖2不同比例Penetratin修飾脂質(zhì)體被細胞攝取情況的比較Fig 2 Comparison of cellular uptake of different proportions of Penetratin modified liposomes

2.2 脂質(zhì)體的表征

Lip的平均粒徑為（143.87±2.49）nm，PDI為0.241±0.021；Pen-Lip的平均粒徑為（148.07±3.51）nm，PDI為0.227±0.045，呈正態(tài)均勻分布（圖3A）。表明Lip表面修飾Penetratin對粒徑大小沒有顯著影響，脂質(zhì)體顆粒分散性良好。Lip和Pen-Lip的Zeta電位分別為-（3.17±0.55）mV和（5.66±0.91）mV。未修飾時Lip的Zeta電位為負值，對Lip進行表面修飾后，由于Penetratin帶正電荷，Pen-Lip的Zeta電位變?yōu)檎?。TEM拍攝結果如圖3B所示，可以看出Pen-Lip呈外表光滑的球形結構。通過ELISA檢測得到Lip的包封率為（40.47±3.46）%，載藥量為（2.61±0.22）%；Pen-Lip的包封率為（44.06±3.70）%，載藥量為（2.84±0.24）%，修飾前后包封率和載藥量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

圖4A是不同時間點的脂質(zhì)體粒徑大小，可以看出Lip和Pen-Lip在PBS和含50%FBS的PBS溶液中靜置48 h后，平均粒徑變化不大，基本維持其原本粒徑大小，TEM結果（圖4B，C）顯示Lip、Pen-Lip靜置48 h后分散均勻，沒有發(fā)生聚集，穩(wěn)定性較好。

圖4 Lip和Pen-Lip的穩(wěn)定性Fig 4 Stability of Lip and Pen-Lip

2.4 脂質(zhì)體的細胞毒性

使用角膜上皮細胞HCEC和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞ARPE-19考察了Lip、Pen-Lip對細胞的毒性作用。圖5A表示的是不同濃度的Lip、Pen-Lip處理之后的HCEC的存活率；圖5B表示的是不同濃度的Lip、Pen-Lip處理之后的ARPE-19細胞的存活率。Lip、Pen-Lip濃度在15μg/mL和500μg/mL范圍內(nèi)時，角膜細胞和視網(wǎng)膜細胞均有90%以上的細胞存活率，2種細胞的生長未受明顯影響；表明Lip、Pen-Lip對角膜細胞和視網(wǎng)膜細胞的毒性均較低，生物相容性較高。

2.5 細胞對脂質(zhì)體的攝取情況

在ARPE-19細胞分別與Nr染料、Lip/Nr和Pen-Lip/Nr共孵育3 h后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞對于脂質(zhì)體的攝取情況。如圖6A所示，各組在ARPE-19細胞中均有熒光分布，Nr染料組僅有微弱的紅色熒光，Lip/Nr組有少量的紅色熒光，Pen-Lip/Nr組熒光強度最強。用Image J對熒光強度進行半定量分析（圖6B），Pen-Lip/Nr組的平均熒光強度分別是Lip/Nr組、Nr染料組的1.7倍和2.6倍，差異均有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），表明ARPE-19細胞對Pen-Lip的攝取能力最強。

2.6 對離體角膜的滲透性和組織毒性

如圖7A所示，隨著滲透時間的增加，Pen-Lip/GFP穿透兔角膜進入下室的熒光強度越強，呈時間依賴性。Pen-Lip/GFP組、Lip/GFP組的表觀滲透系數(shù)分別是GFP組的5.95和2.19倍（圖7B），表明脂質(zhì)體由于其類似于細胞膜的磷脂雙分子層結構，可以改善藥物的角膜穿透能力。如圖7C所示，Conb、Lip/Conb、Pen-Lip/Conb透過兔角膜4 h后，ELISA檢測到下室中Conb累積量分別為（20.4±3.1）、（42.0±5.0）、（118.9±12.5）μg/mL，Pen-Lip/Conb組的藥物累積量分別是Conb組、Lip/Conb組的5.83倍和2.83倍（均P=0.000），表明Penetratin的修飾可以顯著提高藥物的角膜透過能力。經(jīng)Conb、Lip/Conb、Pen-Lip/Conb處理的兔角膜的水合值與未處理對照組差異均無統(tǒng)計學意義，表明在本研究使用的濃度范圍內(nèi)未觀察到脂質(zhì)體的體外組織毒性（圖7D）。

圖6 ARPE-19細胞對Nr染料、Lip/Nr和Pen-Lip/Nr的攝取情況比較Fig 6 Comparison of uptake of Nr,Lip/Nr and Pen-Lip/Nr by ARPE-19 cells

圖7載藥Lip和Pen-Lip對離體兔角膜的滲透性和組織毒性檢測Fig 7 Detection of permeability and tissue toxicity of drug-loaded Lip and Pen-Lip on rabbit corneas in vitro

3 討論

Conb是臨床上常用的治療眼底新生血管疾病的生物藥物，是一種大分子蛋白類藥物，容易受到酸堿度、溫度以及有機溶劑的影響而失活。本研究選用較溫和的薄膜分散法制備載藥脂質(zhì)體，在冰上進行水浴超聲減小粒徑，減小超聲時溫度升高對藥物活性的影響。用聚乙二醇對脂質(zhì)體表面進行修飾是一項在腫瘤納米給藥系統(tǒng)廣泛使用的技術，可以延長脂質(zhì)體的循環(huán)時間，但在眼部給藥方面對該技術的研究較少。當DSPE-PEG2000占總脂質(zhì)材料的摩爾比為5%～7%時，脂質(zhì)體表面的聚乙二醇呈刷子狀［19］，可在空間上減少脂質(zhì)體與玻璃體成分之間的靜電相互作用，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，增加脂質(zhì)體在玻璃體腔的遷移率，使其能夠到達視網(wǎng)膜區(qū)域［20］。因此本研究在制備脂質(zhì)體的過程中加入了5%摩爾比的DSPEPEG2000，穩(wěn)定性檢測結果表明脂質(zhì)體在48 h內(nèi)粒徑變化很小，沒有發(fā)生明顯聚集，穩(wěn)定性較好。

眼表局部給藥時，角膜是藥物吸收進入眼內(nèi)的主要屏障，脂質(zhì)體具有親脂親水性，能增強藥物的角膜穿透能力，可作為滴眼給藥治療眼后段疾病的載體。有研究［7］利用多糖的生物黏附性將殼聚糖涂覆在脂質(zhì)體表面，延長脂質(zhì)體在眼表的滯留時間并提高藥物向眼后段的滲透性，但脂質(zhì)體覆蓋殼聚糖涂層之后進入眼后段的熒光蛋白僅約為未修飾脂質(zhì)體的1.5倍。膜聯(lián)蛋白A5是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，Davis等［21］將其連接在脂質(zhì)體表面，增強脂質(zhì)體穿透角膜上皮屏障的能力，然而膜聯(lián)蛋白A5修飾的脂質(zhì)體僅比未修飾脂質(zhì)體提升了不到2倍的穿透效果。本研究結果顯示Penetratin修飾脂質(zhì)體后，角膜穿透能力與Lip相比提升了近3倍，較殼聚糖、膜聯(lián)蛋白A5等眼部促滲劑具有更好的促進角膜穿透作用。

Penetratin是一種多肽。與一些通過損害角膜完整性而起作用的化學滲透促進劑相比，多肽生物相容性高，適用于眼部給藥。本研究采用Penetratin修飾脂質(zhì)體，結果顯示Pen-Lip生物相容性好，組織毒性低，是一種安全的眼部藥物載體。

本研究構建了Pen-Lip用于眼部給藥，初步結果顯示Pen-Lip可被視網(wǎng)膜色素上皮細胞攝取，具有有效的離體兔角膜穿透能力，有望作為一種安全、有效的能透過角膜屏障作用于眼底的給藥系統(tǒng)，實現(xiàn)通過局部滴眼給藥治療眼底新生血管疾病。在后續(xù)的工作中，我們將進一步研究Pen-Lip抗眼底新生血管疾病的作用效果。

參·考·文·獻

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