成人與兒童急性髓系白血病患者腫瘤免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

李玲玲，李倩，李明玉，劉崢，沈倩誠(chéng)

1.上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200062；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物信息學(xué)中心，上海200025；3.上海工程技術(shù)大學(xué)管理學(xué)院，上海201620

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一類(lèi)發(fā)病機(jī)制具有高度異質(zhì)性的造血干細(xì)胞異常的克隆性疾病，由于患者骨髓中不同分化階段的髓系細(xì)胞分化阻滯與異常增殖，常出現(xiàn)造血功能衰竭、髓外器官浸潤(rùn)、代謝功能異常等臨床表現(xiàn)［1］。AML可發(fā)生于任何年齡，在兒童急性白血病中的占比約為30%，在成人急性白血病中的占比約為80%?；加蠥ML的兒童長(zhǎng)期生存率為40%～60%，60歲以下的中青年患者長(zhǎng)期生存率為35%～40%，60歲以上的老年患者則為5%～15%［2］。AML的預(yù)后不良多與復(fù)發(fā)和治療相關(guān)的并發(fā)癥有關(guān)。盡管AML的細(xì)胞分型和基因分型是預(yù)測(cè)患者生存率的重要指標(biāo)，但年齡仍然是重要的預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因素之一，除了可能與老年人的身體條件較差有關(guān)以外，還可能與不同年齡階段的骨髓免疫基因表達(dá)差異有關(guān)。AML表現(xiàn)為造血干細(xì)胞的分化異常，這與免疫基因的表達(dá)密不可分。腫瘤免疫相關(guān)基因的表達(dá)是免疫細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞因子之間相互作用的結(jié)果，它們共同進(jìn)化，最終形成了對(duì)腫瘤有支持作用的腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)了白血病的發(fā)生、發(fā)展［3］。

為了探討AML患者骨髓中腫瘤免疫相關(guān)基因的表達(dá)是否影響患者的長(zhǎng)期生存率，本研究對(duì)GSE134589數(shù)據(jù)集中不同年齡段的AML患者骨髓中的腫瘤免疫相關(guān)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)不同年齡段的生存率差異［2］，將AML患者分為兒童組、中青年組和老年組，篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），探究骨髓中腫瘤免疫相關(guān)的DEGs與成人AML預(yù)后較差的相關(guān)性，并尋找對(duì)AML發(fā)展有關(guān)鍵影響的免疫基因。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選

在GEO（Gene Expression Omnibus）［4］數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）搜索并下載GSE134589數(shù)據(jù)集。此數(shù)據(jù)集是基于GPL26936平臺(tái)，檢測(cè)了442例AML患者骨髓穿刺樣本的730個(gè)免疫相關(guān)基因的芯片數(shù)據(jù)［5］，包含基因表達(dá)矩陣和樣本信息，如取樣時(shí)的患者狀態(tài)、年齡、取樣部位、RNA的處理方法、芯片信息等。另一部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于UCSC Genome Browser網(wǎng)站［6］（https://xenabrowser.net/datapages/）的TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）AML數(shù)據(jù)集和GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://gtexportal.org/home/）正常組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)集。

1.2 DEGs篩選

根據(jù)長(zhǎng)期生存率的差異［2］，將數(shù)據(jù)分為兒童組（0～16歲）、中青年組（17～59歲）、老年組（60～80歲），選取初次確診與復(fù)發(fā)的樣本，其中兒童組34例，中青年組62例，老年組62例?；虮磉_(dá)的差異用FDR（false discovery rate）校 正 后 的P值（q-value）和 差 異 倍 數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對(duì)數(shù)（log2FC）表示。本研究以qvalue＜0.01且|log2FC|＞2為篩選條件，使用R語(yǔ)言（版本4.0.2）limma、pheatmap、ggplot2等程序包［7］分析中青年組與兒童組、老年組與兒童組、中青年組與老年組的DEGs。選擇取樣時(shí)患者狀態(tài)為完全緩解的樣本，以同樣的條件篩選兒童組（5例）和成人組（17～80歲，23例）的DEGs，并與初次確診/復(fù)發(fā)樣本的DEGs進(jìn)行比較。

1.3 富集分析

取中青年與兒童AML患者的DEGs和老年與兒童AML患者的DEGs的交集，繪制韋恩圖，取共同上調(diào)或下調(diào)的DEGs，使用Metascape.org［8］映射到GO（Gene Ontology）、Reactome和KEGG（Kytoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的生物過(guò)程和信號(hào)通路，將P＜0.05作為其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)。

1.4 DEGs的mRNA表達(dá)及其與總體生存期的相關(guān)性分析

GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）是一個(gè)交互式網(wǎng)站服務(wù)器［9］，包含TCGA和GTEx項(xiàng)目的33種癌癥和正常樣品的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)TPM（transcripts per million）歸一化方法，將AML患者分為DEG高表達(dá)組（53例）和DEG低表達(dá)組（53例），采用Kaplan-Meier法分析以上2組組織中DEGs對(duì)AML總體生存期的影響，篩選與預(yù)后顯著相關(guān)的基因，將其作為關(guān)鍵基因。

1.5 構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

使用在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING（https://string-db.org/）分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）［10］，構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)；采用Cytoscape 3.8.0軟件 進(jìn) 行 可 視 化［11］，并 使 用Cytoscape的CytoHubba插件［12］的EPC（edge percolated component）拓?fù)浞治龇椒êY選連接度高的為有主要作用的蛋白分子。分別用Cytoscape的MCODE［13］與Metascape.org在線(xiàn)工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行密集度分析，進(jìn)一步篩選PPI網(wǎng)絡(luò)最顯著模塊的中心節(jié)點(diǎn)基因，也將其作為關(guān)鍵基因。

1.6 關(guān)鍵基因驗(yàn)證

利用GEPIA網(wǎng)站對(duì)關(guān)鍵基因在173例AML患者白細(xì)胞樣本與70例正常人白細(xì)胞樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證；同時(shí)橫向?qū)Ρ汝P(guān)鍵基因在47例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）腫瘤組織與337例正常人全血樣本、118例胸腺癌（thymoma，THYM）腫瘤組織與337例正常人全血樣本以及2例正常胸腺組織樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的功能。從Gene Expression Commons（https://gexc.riken.jp/models/7/genes）下載數(shù)據(jù)［14］，分析關(guān)鍵基因在AML患者腫瘤干細(xì)胞和健康造血細(xì)胞中mRNA的表達(dá)情況，篩選具有腫瘤干細(xì)胞特異性的基因。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡段AML患者腫瘤免疫相關(guān)的DEGs聚類(lèi)分析

本研究用R語(yǔ)言分析來(lái)源于數(shù)據(jù)集GSE134589的DEGs。將初次確診與復(fù)發(fā)的樣本分為兒童組34例、中青年組62例、老年組62例。從熱圖中，可以看出中青年組與兒童組（圖1A）、老年組與兒童組（圖1B）免疫相關(guān)基因的差異區(qū)分明顯，組內(nèi)基因表達(dá)情況具有高度一致性。

2.2 不同年齡段AML患者腫瘤免疫相關(guān)DEGs的篩選

將 參 數(shù) 符 合q-value＜0.01且|log2FC|＞2的 基 因 視 為DEGs，使用R語(yǔ)言繪制AML患者骨髓中腫瘤免疫相關(guān)基因的火山圖。中青年組與兒童組比，結(jié)果顯示上調(diào)的DEGs有51個(gè)，下調(diào)的有21個(gè)（圖2A）；老年組與兒童組比，上調(diào)的DEGs有47個(gè)，下調(diào)的有20個(gè)（圖2B）；而中青年組與老年組比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DEG（圖2C），提示兒童與成人（包括老年人）AML患者骨髓中腫瘤免疫相關(guān)基因的表達(dá)具有顯著差異，而成年后患者間的差異不明顯。

2.3 DEGs的韋恩圖和富集分析

從DEGs的韋恩圖可知，相比兒童組，中青年組和老年組共同上調(diào)的基因有39個(gè)（圖3A）；共同下調(diào)的基因有18個(gè)（圖3C）。為了探索DEGs相關(guān)的信號(hào)通路，用Metascape.org網(wǎng)站對(duì)39個(gè)共同上調(diào)的基因和18個(gè)共同下調(diào)的基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示共同上調(diào)的DEGs主要富集在白細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、造血細(xì)胞譜系、髓 系 白 細(xì) 胞 激 活、核 因 子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路和白介素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等（圖3B）；共同下調(diào)的DEGs主要富集在細(xì)胞對(duì)脂多糖的響應(yīng)、白細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)的正向調(diào)控、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移的調(diào)控和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等（圖3D）。

分析完全緩解狀態(tài)下的成人與兒童AML患者腫瘤免疫相關(guān)基因的差異，與發(fā)病期內(nèi)篩選出的共同DEGs比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，僅白細(xì)胞表面抗原CD53（leukocyte surface antigen CD53，CD53）、原癌基因c-Rel（proto-oncogene c-Rel，REL）、趨化因子配體2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）這3個(gè)基因相同，發(fā)病期間成人與兒童之間的DEGs絕大部分在病情完全緩解后表達(dá)不再呈現(xiàn)差異（表1）。說(shuō)明成人與兒童骨髓中的腫瘤免疫相關(guān)基因在AML發(fā)病過(guò)程中表達(dá)的差異多數(shù)與疾病有關(guān)，以成人和兒童分組來(lái)分析AML患者的DEGs具有生物學(xué)意義。

2.4 影響AML患者總體生存期的基因篩選

圖1不同年齡分組的AML患者腫瘤免疫相關(guān)基因表達(dá)的熱圖分析Fig 1 Heatmap analysis of tumor immune-related genes expression in the AML patients of different age groups

為了探索DEGs與患者預(yù)后的相關(guān)性，使用Kaplan-Meier法分析DEGs的mRNA表達(dá)量對(duì)AML患者總體生存期的影響。結(jié)果顯示在成人AML患者骨髓中上調(diào)的DEGs中，IL2RA和FLT3基因高表達(dá)組患者的總體生存期顯著縮短（圖4）；下調(diào)的DEGs均對(duì)患者總體生存期無(wú)顯著影響。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵模塊篩選

使用在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING分析39個(gè)共同上調(diào)DEGs對(duì)應(yīng)的蛋白之間的相互作用，通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析（圖5A），采用Cytoscape的CytoHubba插件篩選連接度最高的18個(gè)主要蛋白分子，包含IL2RA、FLT3、C3AR1、趨化因子和黏附因子等（圖5B）。分別用Cytoscape的MCODE與Metascape.org在線(xiàn)工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行密集度分析，得出最顯著模塊均是以C3AR1為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖5C）。

圖2不同年齡分組的AML患者腫瘤免疫相關(guān)基因的火山圖分析Fig 2 Volcano map analysis of tumor immune-related genes in the AML patients of different age groups

圖3不同年齡分組的AML患者腫瘤免疫相關(guān)DEGs的韋恩圖與富集分析Fig 3 Venn map and enrichment analysis of tumor immune-related DEGs in the AML patients of different age groups

表1 AML患者在初次確診/復(fù)發(fā)和完全緩解狀態(tài)下的腫瘤免疫相關(guān)DEGs的比較Tab 1 Comparison of tumor immune-related DEGs between the AML patients in initial diagnosis/relapse and in complete remission

圖4 IL2RA和FLT3 mRNA不同表達(dá)水平的AML患者的總體生存期分析Fig 4 Overall survival analysis of the AML patients with different levels of IL2RA and FLT3 mRNA expression

圖5上調(diào)DEGs對(duì)應(yīng)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)與最顯著模塊圖Fig 5 PPI network and the most significant modules of up-regulated DEGs-corresponding proteins

2.6 關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

綜合分析生存曲線(xiàn)和PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵模塊，結(jié)果顯示高表達(dá)IL2RA、FLT3的AML患者預(yù)后較差，而C3AR1在AML骨髓免疫的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)里有重要作用，它們可能是對(duì)成人預(yù)后有關(guān)鍵影響的DEGs，因此作為關(guān)鍵基因。將GEPIA網(wǎng)站提供的AML、DLBCL和THYM患者的腫瘤樣本和正常人樣本的IL2RA、FLT3、C3AR1表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IL2RA、FLT3、C3AR1均在AML患者樣本中高表達(dá)，在正常人樣本中低表達(dá)（圖6A）。此外，IL2RA還在DLBCL患者樣本中顯著高表達(dá)，而在THYM患者樣本中無(wú)明顯變化（圖6A）。

從Gene Expression Commons下載數(shù)據(jù)，分析關(guān)鍵基因在正常人骨髓和臍帶血的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、CD45 RA陽(yáng)性祖細(xì)胞等原始造血細(xì)胞以及AML患者的腫瘤干細(xì)胞、祖細(xì)胞和芽細(xì)胞共12種低分化造血細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，IL2RA均呈低表達(dá)（圖6B），提示IL2RA可能表達(dá)在分化較成熟的造血細(xì)胞上。同樣，通過(guò)分析FLT3和C3AR1表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3在多數(shù)低分化造血細(xì)胞中均高表達(dá)（圖6B），在DLBCL、THYM患者樣本和正常人樣本中均低表達(dá)（圖6A），提示FLT3僅表達(dá)在未分化成熟的細(xì)胞上，在淋巴、胸腺和血液中分化相對(duì)成熟的細(xì)胞上呈低表達(dá)；而FLT3在AML腫瘤樣本高表達(dá)，推測(cè)可能與腫瘤干細(xì)胞的增殖有關(guān)。C3AR1在AML患者的腫瘤干細(xì)胞、祖細(xì)胞和芽細(xì)胞中高表達(dá)，在正常的骨髓和臍帶血的原始造血細(xì)胞中低表達(dá)（圖6B），提示其可能具有在腫瘤干細(xì)胞特異性高表達(dá)的特征。

圖6關(guān)鍵基因在3個(gè)病種腫瘤組織中以及在AML患者腫瘤干細(xì)胞與正常人造血細(xì)胞中的mRNA表達(dá)情況Fig 6 mRNA expression of key genes in the tumor tissues of the three diseases and in the tumor stem cells of the AML patients and the hematopoietic cells of normal people

3 討論

免疫細(xì)胞與白血病干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和各種細(xì)胞因子等相互作用共同組成了骨髓腫瘤免疫抑制性微環(huán)境［15］。隨著腫瘤的發(fā)展，免疫細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)量也會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變［5］，從免疫細(xì)胞的遷移、抑制性細(xì)胞因子釋放、腫瘤表面抑制性受體上調(diào)、基質(zhì)重塑和代謝異常等方面影響著腫瘤微環(huán)境［16］。AML是一種免疫細(xì)胞分化異常的腫瘤，從形態(tài)學(xué)上分為M0～M7共8個(gè)亞型［17］；除了M3以外，其他亞型的預(yù)后并不理想，成人的患病率明顯高于兒童而治愈率低于兒童。通過(guò)對(duì)比成人與兒童AML患者骨髓中腫瘤免疫相關(guān)基因的差異，可能有助于找到兩者預(yù)后差異的原因。

本研究分析了來(lái)源于GEO的GSE134589數(shù)據(jù)集，熱圖結(jié)果顯示成人與兒童AML患者骨髓中的多個(gè)腫瘤免疫相關(guān)基因的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中成人患者中高表達(dá)的IL2RA基因可通過(guò)控制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的活性，抑制T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受［18-19］。FLT3是原癌基因，參與調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞增殖，是AML患者中最常見(jiàn)的突變基因之一，即使在沒(méi)有FLT3突變的情況下，芽細(xì)胞高表達(dá)FLT3可能與AML患者預(yù)后不良有關(guān)［20］。C3AR1屬于G蛋白偶聯(lián)受體的超家族成員，含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，補(bǔ)體C3a-C3aR軸能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞對(duì)Ⅰ型血管細(xì)胞黏附蛋白的黏附、增加造血干細(xì)胞對(duì)CXCL12的趨化敏感性［21］。CXCL12是已知的唯一對(duì)造血干細(xì)胞有趨化作用的因子，CXCL12-CXC趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）軸在造血干細(xì)胞的歸巢和外周干細(xì)胞的動(dòng)員中扮演著重要角色［22］。研究［23］表明，在腫瘤中CXCL12-CXCR4軸可激活NF-κB通路，增加癌細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力，進(jìn)一步闡明C3a-C3aR與CXCL12-CXCR4軸之間的相互作用可為白血病干細(xì)胞在骨髓和外周的活動(dòng)提供理論基礎(chǔ)。成人AML患者發(fā)病期間特異性上調(diào)表達(dá)的基因中，CD97、IL1RAP是白血病干細(xì)胞關(guān)鍵的調(diào)控基因，是預(yù)后不良的指標(biāo)［24-25］；BCL2L1是BCL-2抗凋亡家族基因［26］；IL-6可刺激骨髓瘤細(xì)胞的增殖［27］；ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體主要通過(guò)ATP水解釋放能量將藥物分子泵出細(xì)胞［28］，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞藥物蓄積減少和多藥耐藥性的發(fā)展；CCL2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲［29］等。這些基因在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，它們的差異可能是成人預(yù)后比兒童差的影響因素。

利用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)和Cytoscape軟件篩選了3個(gè)潛在的對(duì)AML疾病發(fā)展有重要影響的關(guān)鍵基因：IL2RA、FLT3和C3AR1。對(duì)GEPIA網(wǎng)站提供的AML腫瘤組織和正常人樣本的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3個(gè)關(guān)鍵基因在AML腫瘤樣本顯著高表達(dá)，具有腫瘤組織特異性。IL2RA在正常的原始造血細(xì)胞和AML腫瘤干細(xì)胞上均低表達(dá)，推測(cè)其主要在分化較成熟的細(xì)胞上表達(dá)。然而，和正常人樣本相比，IL2RA在AML和DLBCL中顯著高表達(dá)，在THYM中無(wú)明顯差異。DLBCL是腫瘤性大B淋巴細(xì)胞呈彌漫性生長(zhǎng)的腫瘤，而B(niǎo)細(xì)胞是在骨髓中發(fā)育成熟的，推測(cè)AML患者骨髓中IL2RA的高表達(dá)可能與B細(xì)胞有關(guān)。有研究［18-19］證明B細(xì)胞可誘導(dǎo)Treg的分化，而Treg抑制反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增，介導(dǎo)的免疫抑制是至關(guān)重要的腫瘤免疫逃逸機(jī)制之一。FLT3主要表達(dá)在未分化成熟的細(xì)胞上，它的高表達(dá)可能與腫瘤干細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。而C3AR1具有在AML腫瘤干細(xì)胞中特異性高表達(dá)的特征，可作為AML的潛在靶分子開(kāi)展進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法綜合分析了不同年齡段的AML患者骨髓中腫瘤免疫相關(guān)基因，結(jié)果顯示成人與兒童AML患者預(yù)后的差異與其中的DEGs有關(guān)，進(jìn)而篩選出了對(duì)AML疾病發(fā)展可能有不利影響的關(guān)鍵基因，并預(yù)測(cè)了它們?cè)谀[瘤發(fā)展中的功能，為不同年齡段AML患者的免疫治療和實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的方向。

參·考·文·獻(xiàn)

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