生物信息學(xué)方法篩選胰腺癌進(jìn)展相關(guān)的核心基因

楊鹿笛，王高明，胡仁豪，蔣小華，崔然

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金臨床醫(yī)學(xué)院，上海200025；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院普外科，上海200120

胰腺癌是一種頑固性惡性腫瘤，惡性程度較高。根據(jù)2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［1］，胰腺癌位列常見(jiàn)癌癥排名第11位，2018年有458 918個(gè)新病例，432 242人因胰腺癌死亡（占所有癌癥死亡人數(shù)的4.5%），5年生存率低于5%。在美國(guó)，癌癥患者中胰腺癌已成為第三大死亡原因［2］。近年來(lái)發(fā)展中國(guó)家人們生活方式的改變，比如吸煙比例提高、高熱量食物攝入增多、體育鍛煉缺乏等，導(dǎo)致胰腺癌死亡率逐漸上升［3］。

胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者在確診時(shí)已喪失治療的最佳時(shí)機(jī)；同時(shí)，胰腺癌手術(shù)切除率較低，并且對(duì)常規(guī)放射治療和化學(xué)治療不敏感，故預(yù)后極差［1］。胰腺癌具有快速增殖能力和高度侵襲轉(zhuǎn)移傾向，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的系統(tǒng)治療手段。高通量測(cè)序技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)的不斷發(fā)展，有助于更好地了解胰腺癌潛在的分子機(jī)制，尋找新的分子靶標(biāo)和靶向療法，從而延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。

隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的生物信息科學(xué)，成為分析基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的一種重要方法。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)的分析方法，篩選與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的核心基因與通路，探究核心基因?qū)σ认侔┗颊哳A(yù)后的影響，以期為胰腺癌患者的精準(zhǔn)治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)來(lái)源

利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）平 臺(tái) 下 的GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索含有人源胰腺癌及癌旁組織樣本的芯片數(shù)據(jù)集GSE28735。該數(shù)據(jù)集共包含90例組織樣本數(shù)據(jù)，其中45例為癌組織，45例為癌旁正常組織。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

通過(guò)GEO2R在線分析工具提取癌組織及癌旁組織的基因。為了提高篩選效率，首先利用RStudio軟件，以P值大小為參考標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)最顯著的250個(gè)基因；然后通過(guò)RStudio軟件的limma數(shù)據(jù)包進(jìn)一步篩選胰腺癌組織樣本和癌旁正常組織樣本的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05且|log2FC|＞1［FC為差異倍數(shù)（fold change）］。利用pheatmap、ggplot2數(shù)據(jù)包對(duì)其進(jìn)行可視化處理。

1.3 DEGs的富集分析

在基因功能注釋在線工具DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）中，根據(jù)基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行生物學(xué)富集分析。在RStudio軟件中，以P＜0.05為入選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行篩選，利用ggplot2數(shù)據(jù)包對(duì)富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)交互基因檢索工具STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）對(duì)差異表達(dá)顯著的基因在線繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，以結(jié)合分?jǐn)?shù)＞0.4為閾值條件。在Cytoscape軟件中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，使用CytoHubba網(wǎng)絡(luò)分析插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.5 核心基因表達(dá)水平的生存分析和病理階段分析

基因表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）納入了179例胰腺癌患者的臨床和病理信息以及基因表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證5個(gè)核心基因在179例胰腺癌組織和171例正常組織中的表達(dá)差異；利用基因表達(dá)水平中位數(shù)將患者分為基因高表達(dá)組（89例）和基因低表達(dá)組（89例），并繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，探究核心基因表達(dá)水平的高低與患者總生存期（overall survival，OS）和無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）的關(guān)聯(lián)；通過(guò)GEPIA在線分析和單因素方差分析對(duì)不同病理階段的基因表達(dá)水平進(jìn)行可視化處理及統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選

為了提高篩選效率，我們將GEO2R在線分析結(jié)果根據(jù)P值大小升序排列，選取其中的前250個(gè)基因。在R語(yǔ)言limma包中設(shè)置差異基因篩選條件為P＜0.05且|log2FC|＞1，共得到131個(gè)DEGs，其中與癌旁正常組織相比表達(dá)上調(diào)的基因115個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因16個(gè)。利用R的ggplot2和pheatmap數(shù)據(jù)包分別對(duì)前250個(gè)基因和篩選出來(lái)的131個(gè)DEGs進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖1。

圖1胰腺癌組織及癌旁組織中DEGs的可視化分析Fig 1 Visual analysis of the DEGs in pancreatic cancer and adjacent tissues

2.2 DEGs的富集分析結(jié)果

對(duì)篩選得到的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果表明DEGs主要在細(xì)胞黏附、質(zhì)膜、蛋白質(zhì)結(jié)合中富集；主要富集的通路為磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路。對(duì)DEGs的富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖2。

圖2 DEGs的GO功能富集和KEGG通路富集分析Fig 2 Enrichment analysis of GO function and KEGG pathway of DEGs

2.3 PPI的構(gòu)建與核心基因的篩選

利用STRING在線分析DEGs對(duì)應(yīng)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行整合后構(gòu)建PPI的可視化結(jié)果，獲得DEGs對(duì)應(yīng)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。通過(guò)使用CytoHubba網(wǎng)絡(luò)分析插件篩選PPI中相互作用程度最高的前5個(gè)DEGs的對(duì)應(yīng)蛋白，分別為纖維連接蛋白（fibronectin1，F(xiàn)N1）、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、層 粘 連 蛋 白β3（polyclonal antibody to lamininβ3，LAMB3）、層粘連蛋白α3（laminin subunitα3，LAMA3）、整合素亞單位α3（integrin subunitα3，ITGA3）。其生物學(xué)功能及節(jié)點(diǎn)度值（degree）具體見(jiàn)表1。

圖3 DEGs對(duì)應(yīng)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of DEGs corresponding proteins

2.4 DEGs表達(dá)水平與患者生存及腫瘤分期的關(guān)系

利用GEPIA在線工具分析5個(gè)DEGs在胰腺癌患者癌組織和癌旁正常組織樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其在癌組織中的表達(dá)水平均高于正常組織，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

5個(gè)DEGs中，MET（P=0.000，HR=2.2）、LAMA3（P=0.000，HR=2.1）、LAMB3（P=0.002，HR=1.9）和ITGA3（P=0.007，HR=1.8）的表達(dá)水平與胰腺癌患者OS有關(guān)，且基因低表達(dá)組（n=89）的預(yù)后明顯優(yōu)于基因高表達(dá)組（n=89）；而FN1（P=0.160，HR=1.3）的表達(dá)水平與胰腺癌患者的OS無(wú)關(guān)聯(lián)（圖5A-E）。DEGs表達(dá)水平與胰腺癌患者DFS的關(guān)聯(lián)分析顯示，MET（P=0.000，HR=2.2）、LAMB3（P=0.023，HR=1.7）和ITGA3（P=0.000，HR=2.4）的表達(dá)水平與胰腺癌患者DFS有關(guān)（圖5G、I、J），而FN1（P=0.140，HR=1.4）和LAMA3（P=0.067，HR=1.5）的表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者的DFS并無(wú)顯著影響（圖5F、H）。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中5個(gè)DEGs的生物學(xué)特點(diǎn)Tab 1 Biological characteristics of the five DEGs in PPI network

圖4 5個(gè)DEGs在179例胰腺癌組織和171例正常組織中的表達(dá)Fig 4 Expression of the five DEGs in 179 cases of pancreatic cancer tissues and 171 cases of adjacent normal tissues

進(jìn)一步探究DEGs表達(dá)水平與胰腺癌分期進(jìn)展的關(guān)系，結(jié)果顯示在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌組織中，F(xiàn)N1（P=0.048）、MET（P=0.010）、LAMA3（P=0.004）和LAMB3（P=0.000）的表達(dá)水平差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ITGA3（P=0.127）在不同分期胰腺癌組織中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

3 討論

胰腺癌是一種遺傳性或獲得性致癌基因突變導(dǎo)致的疾病。由于其具有起病隱匿、早期診斷困難、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療抵抗等特點(diǎn)，患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已進(jìn)展至晚期或已失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，因此預(yù)后較差［4］。目前，關(guān)于胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。因此，深入了解胰腺發(fā)生發(fā)展過(guò)程中失調(diào)的分子是改善胰腺癌患者預(yù)后的重要途徑之一。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，以生物信息學(xué)的方法對(duì)癌組織和癌旁正常組織的DEGs進(jìn)行分析、篩選、整合，對(duì)胰腺癌進(jìn)展的潛在機(jī)制進(jìn)行挖掘。

圖5 Kaplan-Meier曲線分析評(píng)估5個(gè)DEGs對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的意義Fig 5 Prognostic significance of the five DEGs for pancreatic cancer patients assessed via Kaplan-Meier analysis

在GSE28735基因芯片數(shù)據(jù)集中，共篩選出115個(gè)在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)的基因和16個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。GO功能富集分析結(jié)果提示DEGs主要在細(xì)胞黏附、質(zhì)膜、蛋白質(zhì)結(jié)合中富集。KEGG通路富集主要表現(xiàn)在PI3K/AKT信號(hào)通路。綜合富集結(jié)果，可以推測(cè)細(xì)胞黏附功能相關(guān)基因的高表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。細(xì)胞黏附分子參與細(xì)胞的識(shí)別、活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖與分化、伸展與移動(dòng)過(guò)程，是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過(guò)程的分子基礎(chǔ)［5］。在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常觀察到細(xì)胞黏附狀態(tài)改變直接促進(jìn)了癌癥的發(fā)展［6］。Bergmann等［7］在一項(xiàng)包含胰腺癌前病變、原發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌以及胰腺癌肝轉(zhuǎn)移組織的大樣本隊(duì)列試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌中L1細(xì)胞黏附分子的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性率達(dá)92.7%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)80.0%，肝轉(zhuǎn)移率達(dá)100%，提示L1細(xì)胞黏附分子的表達(dá)與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。另有研究［8］表明，L1細(xì)胞黏附分子可以通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）等途徑在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起作用。由此可見(jiàn)，細(xì)胞黏附分子在胰腺癌組織與正常組織中的表達(dá)水平存在差異，且細(xì)胞黏附分子與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

PI3K/AKT信號(hào)通路主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等［9］。該通路活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)［10］。已有研究［11］表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。通過(guò)研究阻斷PI3K/AKT通路產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的分子機(jī)制可以為新型抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供新靶點(diǎn)和新思路，進(jìn)而增強(qiáng)化學(xué)治療藥物對(duì)胰腺癌的敏感性，使特異性抗癌新藥的研發(fā)成為可能［12］。本研究KEGG富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，該結(jié)果為尋找胰腺癌新的治療靶點(diǎn)提供了方向。

圖6 5個(gè)DEGs在不同病理分期胰腺癌中的表達(dá)Fig 6 Expression of the five DEGs in pancreatic carcinoma with different pathological stages

通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，探究DEGs表達(dá)的蛋白之間的相互作用。運(yùn)用CytoHubba插件篩選出節(jié)點(diǎn)度值最高的5個(gè)DEGs。MET、LAMA3、LAMB3對(duì)患者的OS或DFS有顯著影響并且在不同病理階段的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)MET、LAMA3、LAMB3可能成為胰腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)、診斷、靶向治療的潛在靶標(biāo)。

MET是一種原癌基因，編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的異二聚體跨膜受體酪氨酸激酶，可作為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）的受體。HGF與MET蛋白結(jié)合可觸發(fā)PI3K/AKT信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路［13］。這些通路的激活可以驅(qū)動(dòng)與癌癥有關(guān)的各種生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡抑制、上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及血管生成等［13-14］。據(jù)報(bào)道，在人類(lèi)幾種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了MET蛋白的失調(diào)和擴(kuò)增，其中包括胃癌［15］、結(jié)直腸癌［16］、乳腺癌［17］和非小細(xì)胞肺癌［18］。已有研究［19］證實(shí)受體酪氨酸激酶c-Met與胰腺癌的發(fā)病機(jī)制之間存在關(guān)聯(lián)。Neuzillet等［20］研究表明，胰腺癌組織中c-Met表達(dá)的增加伴隨著復(fù)發(fā)率的提高和生存時(shí)間的縮短。有文獻(xiàn)［21］表明，MET可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)癌癥的發(fā)展。這與我們分析得到的結(jié)果一致。

LAMA3和LAMB3屬于層粘連蛋白家族，是常見(jiàn)的基底膜蛋白家族之一［22］。其廣泛參與許多生物過(guò)程，例如附著、遷移以及與其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的相互作用，并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用［22-24］。研究［25］發(fā)現(xiàn)，LAMA3的表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生有關(guān)，其高表達(dá)可以抑制胃癌的發(fā)生。Svoboda等［26］發(fā)現(xiàn)LAMA3基因在肝癌組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織上調(diào)。同樣，LAMB3的高表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌、肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［27-29］。也有研究［30］表明LAMB3在胰腺癌中異常過(guò)表達(dá)，并且與胰腺癌患者的OS密切相關(guān)。Zhang等［31］還發(fā)現(xiàn)，LAMB3可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌的侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中LAMA3、LAMB3的表達(dá)水平與正常胰腺組織相比明顯升高，且LAMA3、LAMB3高表達(dá)組患者預(yù)后較差，其在胰腺癌不同病理階段的表達(dá)水平的差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這2個(gè)基因可能在胰腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲得5個(gè)在胰腺癌組織異常表達(dá)的DEGs，其可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)胰腺癌的進(jìn)展。其中MET、LAMA3和LAMB3的表達(dá)升高與患者的不良預(yù)后有關(guān)。然而，目前對(duì)MET、LAMA3、LAMB3的上下游調(diào)控關(guān)系及蛋白之間的相互作用關(guān)系尚不明晰，其作為胰腺癌預(yù)后評(píng)判和分子治療靶標(biāo)的價(jià)值仍有待于進(jìn)一步研究。

參·考·文·獻(xiàn)

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