小鼠射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭模型的建立

陳驍楠，張俊峰，王長謙，張繪莉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海200011

美國心臟病學(xué)會（American Heart Association，AHA）和歐洲心臟病學(xué)會（European Society of Cardiology，ESC）的2016年臨床指南按照射血分?jǐn)?shù)＜40%、41%～49%、＞50%，將心力衰竭分為射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)中間范圍的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）［1-2］。HFpEF是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，好發(fā)于老年人、肥胖者、女性，常伴有高血壓、糖尿病、腎功能不全、心房顫動等基礎(chǔ)疾病，約占心力衰竭患者住院人數(shù)的50%，臨床上尚缺乏有效的治療手段［3］。構(gòu)建與臨床發(fā)病特點(diǎn)類似的動物模型，對于進(jìn)一步探索HFpEF的發(fā)生機(jī)制和防治方法具有重要的意義。本研究通過高脂飼養(yǎng)和Nω-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）誘導(dǎo)建立了一種新型小鼠HFpEF動物模型，以期為HFpEF的病理生理機(jī)制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡的SPF級雄性和雌性C57BL/6J小鼠各16只，共32只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0008，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0016。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物房，晝夜節(jié)律規(guī)律，以60%高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）和含有0.5 g/L L-NAME的飲水飼養(yǎng)。研究符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物倫理委員會要求，批件號為SH9H-2019-A416-1。

1.2 試劑與儀器

L-NAME（德國Sigma），Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），蘇木精、伊紅（碧云天生物技術(shù)有限公司），Vevo 3100小動物超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics），Eppendorf 5424小型離心機(jī)（德國Eppendorf），Visitech BP-2000動物血壓計(jì)（美國Visitech System），AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter），Axio Zoom.V16宏觀變倍熒光顯微鏡（德國ZEISS）。

1.3 造模及分組

將雄性和雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成對照組和模型組，每組8只。模型組每日予以充足的60%高脂飼料飼養(yǎng)，每周更換2次含有0.5 g/L L-NAME的飲水。對照組給予普通飼料以及普通飲水喂養(yǎng)，保證食物飲水充足。造模開始時(shí)及造模后第4、8、12、16周測定小鼠體質(zhì)量。造模后第16周小鼠異氟烷氣體麻醉后，經(jīng)眼球取血，4℃、2 200×g離心15 min，取上層血清于-80℃冰箱保存。取血后頸椎脫臼法處死小鼠，分離心臟，電子天平上稱量質(zhì)量后，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4 小動物心臟超聲檢測

造模后每2周進(jìn)行1次小動物心臟超聲檢測。小鼠異氟烷持續(xù)麻醉（0.3～0.5 L/min）后，取仰臥位，同步描記心電圖。采用多普勒超聲心動圖，探頭頻率30 MHz，檢測各組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular enddiastolic diameter，LVEDd）、舒張期左心室前壁厚度（left ventricle anterior wall thickness，LVAWd）、舒張期左心室后壁厚度（left ventricle posterior wall thickness，LVPWd）、左 室 射 血 分 數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、二尖瓣口血流速度（mitral orifice flow velocity，MV）、二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯蹬c晚期血流速度峰值的比值（E/A比值）、二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯蹬c二尖瓣環(huán)舒張?jiān)缙谶\(yùn)動速度峰值的比值（E/E′比值）、左心室整體長軸應(yīng)變（global longitudinal strain，GLS）。連續(xù)測定3個(gè)心動周期，取均值。

1.5 血壓和血脂指標(biāo)檢測

按Visitech BP-2000動物血壓計(jì)說明書操作，采用尾動脈測壓法測量小鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），重復(fù)測量3次，取均值。

按AU5800全自動生化分析儀說明書操作，檢測小鼠血清中三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）。

1.6 心肌組織病理學(xué)檢查

取小鼠心肌組織塊，于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，使用二甲苯滲透，石蠟固定包埋，制成厚度4μm的組織切片。常規(guī)脫蠟至水，梯度乙醇脫水，蘇木精染色3 min，自來水沖洗。1%鹽酸乙醇溶液分化10 s，0.2%氨水沖洗返藍(lán)30 s，自來水沖洗，伊紅復(fù)染3 min，使用梯度乙醇切片脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。按Masson三色染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。使用Axio Zoom.V16宏觀變倍熒光顯微鏡觀察小鼠心肌組織切片病理變化。每個(gè)樣本20倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，通過Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件處理。定量數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上組間比較采用單因素方差分析圖基（tukey）事后檢驗(yàn)法。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型小鼠的體質(zhì)量變化

雄性小鼠自造模后第4周起體質(zhì)量較同性別對照組明顯上升（P＜0.05）；雌性模型組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，第8周起雌性模型組小鼠體質(zhì)量才明顯高于雌性對照組（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 HFpEF模型小鼠體質(zhì)量的變化情況Tab 1 Changes in body weight in the HFpEF mice

2.2 血脂水平的變化

造模后第16周時(shí)，與同性別對照組相比，模型組TAG、TC、HDL-Ch、LDL-Ch水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。此外，雄性模型組小鼠的TC、HDL-Ch的水平高于雌性模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 HFpEF模型小鼠造模后第16周的血脂指標(biāo)情況Tab 2 Changes in blood lipid profiles in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.3 血壓變化

造模后第16周測量小鼠SBP和DBP，發(fā)現(xiàn)與同性別對照組相比，模型組的SBP和DBP水平顯著升高（表3）。雌性模型組小鼠的DBP水平高于雄性模型組。

表3 HFpEF模型小鼠造模后第16周的血壓情況Tab 3 Changes in blood pressure in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.4 心臟質(zhì)量的變化

造模后第16周時(shí)雄性小鼠與同性別對照組相比，心臟質(zhì)量明顯增加，但是心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值出現(xiàn)了一定程度的降低（表4）。雌性模型組小鼠與同性別對照組相比，心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值均出現(xiàn)了明顯上升。

表4 HFpEF模型小鼠造模后第16周的心臟質(zhì)量情況Tab 4 Changes in heart weight in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.5 左心室舒張功能的變化

自造模后第8周起，多普勒超聲心動圖顯示雌性或雄性模型組E/A比值、E/E′比值、GLS均較同性別對照組升高，提示左心室舒張功能明顯降低，但LVEF始終保持穩(wěn)定（圖1）。第16周時(shí)仍可以觀察到上述心臟超聲檢測指標(biāo)的變化趨勢。此外，與雌性模型組小鼠比較，雄性模型組小鼠的E/E′比值升高更加明顯。

圖1 HFpEF模型小鼠LVEF和左心室舒張功能的超聲心動圖改變Fig 1 Echocardiography changes in LVEF and left ventricular diastolic function in the HFpEF mice

2.6 左心室結(jié)構(gòu)的變化

與同性別對照組相比，模型組小鼠的舒張期LVAWd明顯增厚（P=0.002，P=0.000），但舒張期LVPWd以及LVEDd與同性別對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.7 心臟組織的病理改變

病理組織學(xué)結(jié)果顯示：對照組心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，分界清晰，間質(zhì)未見明顯異常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠心肌細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性和肥大，可見局灶性壞死，肌纖維間隙增加、纖維化增加（圖3A、C），并有炎癥細(xì)胞浸潤（圖3B、D）。

3 討論

HFpEF的發(fā)生與年齡、高血壓、糖尿病、血脂異常等多種危險(xiǎn)因素和臨床疾病相關(guān)，病理生理變化復(fù)雜多樣，可能通過內(nèi)皮功能障礙、心臟神經(jīng)體液調(diào)節(jié)異常和系統(tǒng)性炎癥等多個(gè)機(jī)制，影響左心室結(jié)構(gòu)和舒張功能［4-5］。由于HFpEF的上述特殊性，目前缺乏公認(rèn)的、能代表HFpEF臨床特點(diǎn)的動物模型。

圖2 HFpEF小鼠造模后第16周的左心室重構(gòu)情況Fig 2 Left ventricular remodeling in the HFpEF mice at 16 weeks after modeling

圖3 HFpEF小鼠造模后第16周后心肌組織的病理組織學(xué)變化Fig 3 Pathological characteristics in cardiomyocytes of the HFpEF mice at 16 weeks after modeling

HFpEF研究中常用的動物模型主要有壓力負(fù)荷型模型、缺血型模型和復(fù)合型模型。壓力負(fù)荷型HFpEF模型主要通過主動脈縮窄手術(shù)、自發(fā)性高血壓大鼠誘導(dǎo)、繼發(fā)性高血壓大鼠模型或鹽敏感型大鼠誘導(dǎo)，使心臟后負(fù)荷增加，心肌細(xì)胞肥大、纖維化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張功能降低［6-8］。缺血型HFpEF模型主要通過冠狀動脈外慢性收縮、冠狀動脈內(nèi)慢性狹窄和藥物等方法造成心肌慢性缺血，模擬慢性心肌缺血引起的HFpEF［9-11］。復(fù)合型HFpEF模型則綜合了高血壓、血脂異常、糖尿病等多種病理機(jī)制。由于HFpEF往往和多種臨床并發(fā)癥并存，這種復(fù)合型模型更能模擬HFpEF的臨床病理特點(diǎn)［12-13］。雖然，不同類型的HFpEF模型具有不同的發(fā)病機(jī)制和研究針對性，但是復(fù)合模型聯(lián)合了2種以上臨床因素，更貼近HFpEF的臨床特征，可能更具有代表性和普適性，是HFpEF模型的主要發(fā)展方向。

本研究的HFpEF模型屬于復(fù)合型，主要聯(lián)合了LNAME和含60%脂肪的高脂飼料，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)高血壓、高血脂等癥狀，從而誘發(fā)HFpEF形成。已有研究［14］表明高糖和高脂飲食會對小鼠的心臟收縮和舒張功能產(chǎn)生損害，與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。L-NAME是一氧化氮合酶競爭性抑制劑，阻礙內(nèi)皮舒張因子一氧化氮生成，是誘導(dǎo)高血壓動物模型的經(jīng)典藥物。L-NAME采用腹腔內(nèi)注射或溶于飲水中飼喂均可使實(shí)驗(yàn)動物血壓升高，同時(shí)會伴有心臟指數(shù)、小動脈管徑、心肌細(xì)胞直徑、管壁厚度的明顯改變［15-16］。我們將L-NAME（0.5 g/L）溶于飲水中，采用飼喂法，使小鼠穩(wěn)定地受到刺激，保持血壓持續(xù)穩(wěn)定升高，同時(shí)結(jié)合高脂飼料飼喂造模。小鼠無論性別，均可在造模后第8周時(shí)出現(xiàn)左心室舒張功能降低；多普勒超聲心動圖示E/A比值、E/E′比值明顯升高，且LVEF無明顯變化。造模后第16周時(shí)，左心室舒張功能進(jìn)一步降低，且出現(xiàn)了明顯的左心室室壁肥厚、心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化，但未見LVEF和LVEDd明顯變化。本模型不僅模擬了高血壓、高血脂的疾病狀況，而且成模時(shí)間為第8周，可穩(wěn)定持續(xù)至第16周，基本符合高齡這一臨床特點(diǎn)。除了病因模擬，第16周時(shí)小動物心臟超聲和病理組織學(xué)結(jié)果均證實(shí)了左心室舒張功能障礙和心室重構(gòu)的特點(diǎn)，且左心室收縮功能和LVEDd無明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)了本模型的可靠性、穩(wěn)定性和可持續(xù)性。

應(yīng)用L-NAME和高脂雙重刺激誘導(dǎo)HFpEF的造模過程中，雄性和雌性小鼠的成模時(shí)間趨勢基本一致，但是，雄性和雌性小鼠對L-NAME和高脂的雙重刺激的反應(yīng)，具有一定的性別差異。雄性C57BL/6J小鼠高脂飲食后可引起快速的體質(zhì)量增加，雌性C57BL/6J小鼠的體質(zhì)量增加緩慢，不易產(chǎn)生明顯的肥胖。血壓方面，雌性模型組的DBP明顯高于雄性模型組。這些提示在HFpEF的發(fā)生過程中，雄性和雌性的致病驅(qū)動因素可能存在著一定的性別差別。這一現(xiàn)象有助于研究者根據(jù)研究目的和側(cè)重點(diǎn)不同，有針對性地選擇雌性或雄性小鼠進(jìn)行造模。

有學(xué)者［12］應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)自發(fā)高血壓大鼠構(gòu)建高血壓和高血脂HFpEF大鼠模型，但該模型成模時(shí)間至少23周，歷時(shí)較長，造模費(fèi)用偏高。在高血壓模型的基礎(chǔ)上尾靜脈注射鏈脲佐霉素（streptozocin，STZ），建立高血壓糖尿病模型，或者高糖高脂飼料聯(lián)合STZ注射，建立高血糖高血脂模型，均可產(chǎn)生HFpEF的病理特點(diǎn)［13-14］。但是上述2種模型HFpEF持續(xù)時(shí)間較短，易出現(xiàn)左心室擴(kuò)大和射血分?jǐn)?shù)降低，若用于HFpEF方面的研究，必須嚴(yán)格把握造模的條件和時(shí)間。

綜上所述，采用高脂飲食和L-NAME雙重干預(yù)的方法，可以在雄性和雌性小鼠中成功誘導(dǎo)HFpEF。模型穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間長，在研究HFpEF或者左心室舒張功能障礙方面具有良好的應(yīng)用前景；而且雄性和雌性小鼠的HFpEF成模特點(diǎn)具有性別差異，有助于學(xué)者們根據(jù)研究目的和方向有針對性地進(jìn)行模型選擇。

參·考·文·獻(xiàn)

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