N-乙酰半胱氨酸通過調(diào)控ADAM 10表達抑制膿毒癥血清誘導的血管內(nèi)皮細胞高通透性①

方曉玲 宋和鑒 任 斐 李 艷 丁 婕 顧 艷

（連云港市第一人民醫(yī)院心功能室，連云港222000）

膿毒癥是一種因感染誘發(fā)宿主應答失調(diào)而引起的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），具有發(fā)展快、死亡率高等特點，是導致重癥監(jiān)護病房患者多器官衰竭和死亡的主要原因。有研究顯示，血管通透性增高是影響膿毒癥患者預后與轉歸的重要因素［1］。正常的血管通透性是維持組織液生成和回流平衡的關鍵因素，而血管通透性增高可導致毛細血管滲漏，引起繼發(fā)性組織水腫、血容量不足、微循環(huán)障礙以及遠端臟器損傷［2］。因而以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞通透性，維持正常內(nèi)皮屏障為目標的干預方式或許是一種改善膿毒癥的有效方法。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種還原型谷胱甘肽前體，不僅具有很強的抗氧化和抗炎作用，還具有舒張血管、調(diào)節(jié)基因表達和信號轉導的作用，臨床上廣泛用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面疾病的治療［3-4］。有研究表明，NAC主要從抗炎、抗氧化以及改善微循環(huán)等方面發(fā)揮改善膿毒癥的作用，但NAC對膿毒癥血管內(nèi)皮細胞通透性的影響尚不清楚［5］。本研究擬采用膿毒癥患者血清干預的人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926為對象，探討NAC對膿毒癥血清誘導的EA.hy926細胞高通透性的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、藥物與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系EA.hy926購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心；ADAM10抑制劑GI254023X購自美國MedChemExpress公司；NAC購自美國Sigma-Aldrich公司（貨號：A7250）；胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自上海碧云天公司；iScript cDNA合成試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司；兔抗ADAM10、ZO-1、Occludin、VE-cadherin、β-actin及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司。

1.1.2 儀器 MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀購自芬蘭雷勃公司；實時熒光定量PCR儀CFX96購自美國Bio-Rad公司；F-380型熒光分光光度計購自天津港東科技股份有限公司；Millicell ERS-2型電阻儀購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集 選擇本院收治的10例膿毒癥休克患者和10例健康成年志愿者，取患者及志愿者外周靜脈血各5 ml，室溫放置30 min，待其自然凝固后4 000 r/min離心10 min，分離血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞處理及分組 將EA.hy926細胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的恒溫孵箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%左右，根據(jù)實驗分組對細胞進行以下分組處理：空白對照組（Blank）：換用含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；實驗對照組（CON）：換用含10%健康志愿者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；膿毒癥組（Sep）：換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；NAC低劑量組（NAC-L）：采用1 mmol/L NAC預處理24 h后，再換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；NAC高劑量組（NAC-H）：采用5 mmol/L NAC預處理24 h后，再換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；高劑量NAC聯(lián)合ADAM10抑制劑GI254023X組（NAC-H+GI254023X）：先采用20μmol/L GI2540 23X干預16 h，再添加5 mmol/L NAC處理24 h，最后換用含10%膿毒癥患者血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)期EA.hy926細胞，調(diào)整細胞懸液濃度后，以1×104個/ml濃度接種至96孔板中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育至約80%融合度時，根據(jù)實驗分組先進行NAC和GI254023X預處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞0 h、3 h、6 h和12 h，設置5個重復孔。待培養(yǎng)時間結束后，每孔加入10μl 5 mg/ml濃度的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μl二甲基亞砜，置于低速搖床上反應10 min。最后采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測細胞在490 nm處的吸光度。

1.2.4 qRT-PCR法檢測ADAM10 mRNA表達水平 取對數(shù)期EA.hy926細胞接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)實驗分組先進行NAC和GI254023X預處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細胞并采用TRIzol法提取各組細胞總RNA。使用cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板使用熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green Supermix）進行定量檢測。引物序列：ADAM10 F：5′-ATGGGAGGTCAGTATGGGAATC-3′；R：5′-ACTGCTCTTTTGGCACGCT-3′；β-actin F：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；R：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。PCR反應條件：95℃預變性30 s，然后95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，進行40個循環(huán)。以β-actin為模內(nèi)部參考，采用2-ΔΔCt法計算ADAM10 mRNA相對表達量。

1.2.5 Transwell小室法測定單層細胞通透性 取對數(shù)生長期EA.hy926細胞，以1×104個/孔濃度接種至Transwell上室中，培養(yǎng)至形成單層細胞。根據(jù)實驗分組先進行NAC和GI254023X預處理，再加入無血清培養(yǎng)基饑餓4 h，最后加入含有各血清的培養(yǎng)基，同時向上室培養(yǎng)基中加入100μl異硫氰酸熒光素（FITC）標記的葡聚糖（FD40），下室加入1 ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。采用熒光分光光度計分別檢測各組細胞Transwell下室培養(yǎng)液中FITC-FD40的熒光強度，實驗結果以各組細胞熒光強度與空白對照組的熒光強度比值代表單層細胞通透性。

1.2.6 跨內(nèi)皮細胞電阻法檢測EA.hy926細胞的跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）取對數(shù)生長期EA.hy926細胞，以1×104個/孔濃度接種至Transwell上室中，培養(yǎng)至形成單層細胞。根據(jù)實驗分組先進行NAC和GI254023X預處理，再分別將上室中培養(yǎng)基換成含有各血清的培養(yǎng)基，底層小室加入1 ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。將Millicell ERS電阻儀的兩片電極分別垂直置于Transwell上下室中，檢測各小室單層細胞電阻值。

1.2.7 Western blot法檢測細胞ADAM10蛋白、通透性相關蛋白Occludin、閉鎖小帶（ZO-1）、VE-cadherin表達水平 取對數(shù)期EA.hy926細胞接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)實驗分組先進行NAC和GI254023X預處理，再換用含各血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴裂解20 min后離心提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取20μg蛋白沸水浴變性，采用SDS-PAGE技術分離目的蛋白，再用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加一抗兔抗ADAM10（1∶5 000）、Occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、VE-cadherin（1∶2 500）及β-actin（1∶5 000），于4℃孵育過夜。加入二抗室溫下孵育1 h，ECL顯影曝光后，用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白的相對蛋白表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析結果數(shù)據(jù)。結果數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用ANOVA方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t分析；兩組間比較采用t檢驗分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NAC對膿毒癥血清刺激下EA.hy926細胞增殖活性的影響 如表1所示，0 h和3 h各組細胞OD值相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Blank組比較，6 h和12 h Sep組細胞OD值均顯著降低（P＜0.05），而CON組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sep組比較，6 h和12 h NAC-L組細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而NAC-H組細胞OD值明顯增加（P＜0.05）；與NAC-H組比較，6 h和12 h NACH+GI254023X組細胞OD值又明顯增加（P＜0.05）。

2.2 NAC對膿毒癥血清刺激下EA.hy926細胞中ADAM10表達水平的影響 如圖1所示，與Blank組比較，Sep組細胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達水平明顯增加（P＜0.05），而CON組無顯著性差異（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），而NAC-L組無顯著性差異（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NACH+GI254023X組細胞ADAM10 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。

2.3 NAC對膿毒癥血清誘導的EA.hy926細胞通透性及TEER值的影響 如圖2所示，與Blank組比較，Sep組EA.hy926細胞通透性明顯增加（P＜0.05），TEER值顯著降低（P＜0.05），而CON組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細胞通透性明顯降低（P＜0.05），TEER值顯著增加（P＜0.05），而NAC-L組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NAC-H+GI254023X組細胞通透性明顯降低（P＜0.05），TEER值顯著提高（P＜0.05）。

表1 各組不同時間點EA.hy926細胞OD值變化（±s）Tab.1 OD value change of EA.hy926 cells in each group for different times（±s）

表1 各組不同時間點EA.hy926細胞OD值變化（±s）Tab.1 OD value change of EA.hy926 cells in each group for different times（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Blank；2）P＜0.05 vs Sep group；3）P＜0.05 vs NAC-H group.

12 h 0.612±0.093 0.606±0.089 0.392±0.0641）0.408±0.071 0.531±0.0862）0.577±0.0793）Groups Blank CON Sep NAC-L NAC-H NAC-H+GI254023X 0 h 0.364±0.068 0.371±0.072 0.368±0.059 0.370±0.070 0.371±0.052 0.376±0.061 3 h 0.379±0.061 0.380±0.055 0.371±0.063 0.370±0.056 0.373±0.038 0.376±0.051 6 h 0.442±0.037 0.441±0.050 0.383±0.0721）0.383±0.058 0.411±0.0432）0.438±0.0393）

圖1 各組EA.hy926細胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達水平Fig.1 mRNA and protein expression of ADAM 10 in EA.hy926 cells of each group

圖2 各組EA.hy926細胞通透性和TEER值Fig.2 Cell permeability and TEER value of EA.hy926 cells in each group

2.4 NAC對膿毒癥血清刺激下EA.hy926細胞中VE-cadherin、ZO-1及Occludin蛋白表達量的影響如圖3所示，與Blank組比較，Sep組細胞中Occludin、ZO-1及VE-cadherin蛋白表達量明顯下降（P＜0.05），而CON組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sep組比較，NAC-H組細胞中Occludin、ZO-1及VEcadherin蛋白表達量明顯升高（P＜0.05），而NAC-L組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NAC-H組比較，NAC-H+GI254023X組細胞中Occludin、ZO-1及VE-cadherin蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）。

圖3 各組血管內(nèi)皮細胞黏附蛋白VE-cadherin、ZO-1及Occludin表達水平Fig.3 Expression levels of VE-cadherin，ZO-1，Occludin proteins in vascular endothelial cells of each group

3 討論

近年來大量動物實驗表明，NAC對膿毒癥所致的各器官功能損傷具有改善作用，而這些研究均基于NAC的抗炎抗氧化作用［6-7］。然而，臨床上運用NAC治療膿毒癥的效果卻不盡人意，且爭議較大。研究顯示，靜脈注射NAC可降低膿毒癥患者體內(nèi)NF-κB活性，改善膿毒癥患者體內(nèi)氧化反應［8］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，NAC干預治療并不能改善膿毒癥患者死亡率、細胞因子水平和機械通氣持續(xù)時間，甚至還可能加劇膿毒癥引起的心血管衰竭［9］。針對NAC對膿毒癥治療效果出現(xiàn)的歧義，其原因有可能與觀察樣本數(shù)量、給藥劑量、給藥途徑以及用藥時間長短等因素有關，但不可否認NAC對治療膿毒癥具有潛在價值，因而NAC在膿毒癥中更多的作用需要大量實驗去驗證和挖掘。

血管內(nèi)皮屏障是維持血管通透性的重要因素，然而，血管內(nèi)皮細胞是膿毒癥誘導損傷的主要靶位。膿毒癥發(fā)生時，患者體內(nèi)相關炎癥因子以及毒素刺激全身血管內(nèi)皮細胞，造成血管內(nèi)皮細胞結構和功能異常，引起血管通透性增加，最終導致膿毒癥患者組織水腫以及各器官功能障礙［10］。臨床研究證實，膿毒癥患者通常會出現(xiàn)持續(xù)性皮下水腫和體腔水腫，表明降低血管內(nèi)皮細胞高通透性可能成為改善膿毒癥的一種有效措施［11］。本研究通過體外實驗首次證實，NAC可提高膿毒癥血清作用下人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926的增殖活性。此外，由于本研究中NAC均為預處理，而膿毒癥血清作用0 h時各組細胞增殖活性無顯著差異，這些結果表明NAC本身對血管內(nèi)皮細胞增殖無顯著影響，與熊婷等［12］研究結果一致。隨后本研究利用Transwell細胞滲透性實驗和跨內(nèi)皮細胞電阻檢測實驗證實，NAC能夠降低膿毒癥血清誘導的EA.hy926高通透性。VE-cadherin是內(nèi)皮屏障緊密連接的主要跨膜黏附分子，膿毒癥相關促炎因子可通過降低環(huán)磷酸腺苷，損傷VE-cadherin介導的內(nèi)皮細胞附著力，導致血管內(nèi)皮細胞通透性增加［13］。而Occludin和ZO-1也是緊密連接蛋白，可維持細胞與細胞間的張力，是血管內(nèi)皮屏障形成的重要蛋白［2］。本研究結果顯示，NAC能夠上調(diào)膿毒癥血清作用下EA.hy926細胞Occludin、ZO-1及VE-cadherin等蛋白表達，說明NAC通過促進血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白的表達以維持血管內(nèi)皮細胞結構的完整性，進而改善膿毒癥介導的血管內(nèi)皮細胞高通透性。

ADAM10是一種重要的α-分泌酶，能夠觸發(fā)連續(xù)的跨膜蛋白水解過程，可調(diào)控細胞內(nèi)信號的傳遞以及調(diào)節(jié)生長因子、黏附分子、受體和細胞因子的活性。有研究表明，ADAM10可特異性切割緊密連接蛋白VE-cadherin胞外結構域，破壞細胞間緊密連接，促進內(nèi)皮細胞通透性增加［14-15］。本研究結果顯示，膿毒癥血清干預可促進EA.hy926細胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達，表明膿毒癥介導的血管內(nèi)皮細胞通透性增加可能與ADAM10表達增加有關。然而，采用NAC干預可顯著降低膿毒癥血清誘導的ADAM10表達，提示NAC改善膿毒癥介導的血管內(nèi)皮細胞高通透性的機制可能與抑制ADAM10表達有關。進一步采用ADAM10抑制劑GI254023X聯(lián)合NAC干預進行證實，結果顯示GI254023X能顯著增強NAC對膿毒癥血清誘導EA.hy926細胞高通透性的抑制作用，并顯著上調(diào)細胞緊密連接蛋白VE-cadherin、Occludin及ZO-1等蛋白表達水平，表明NAC可能通過抑制ADAM10表達進而降低膿毒癥介導的血管內(nèi)皮細胞高通透性。

綜上所述，本研究采用體外細胞實驗初步闡明NAC可能通過抑制ADAM10表達，進而促進細胞緊密連接蛋白VE-cadherin、Occludin及ZO-1的表達，維持細胞間的緊密連接，從而降低膿毒癥誘導的血管內(nèi)皮細胞高通透性，初步為NAC治療膿毒癥微循環(huán)障礙提供理論依據(jù)，但本研究結論還有待動物水平研究給予進一步驗證。