p53、PVT1基因聯(lián)合miRNA-92a檢測在評估胃癌患者預(yù)后中的價(jià)值

朱曉燕，姚冬穎，郭 軍，郭 治，楊 華，靳 毅

河北省邢臺市人民醫(yī)院：1.腫瘤內(nèi)二科；2.病理科，河北邢臺 054000

胃癌是最為常見的一種惡性消化道腫瘤，其病死率居所有惡性腫瘤的第2位[1]。近年來，隨著我國人口老齡化，人們生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變，胃癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。我國大多數(shù)胃癌患者就診時已處于進(jìn)展期或晚期，治療難度大，預(yù)后差，總體生存時間較短，術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為導(dǎo)致患者死亡最主要的原因[2]。研究顯示，影響胃癌預(yù)后的因素眾多，包括腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)類型、TNM分期、分化程度、浸潤深度、手術(shù)根治類型、轉(zhuǎn)移及放化療等輔助治療方式等[3]，而這些因素都有多種基因的參與和調(diào)節(jié)。因此，探索有效的早期診斷和預(yù)后評價(jià)的檢測指標(biāo)對改善胃癌患者預(yù)后有重要意義。胃癌的發(fā)生和進(jìn)展是一個涉及多種原癌基因激活和抑癌基因失活的漸進(jìn)過程。p53基因是目前研究最為廣泛的一種與人類腫瘤相關(guān)的抑癌基因，其突變產(chǎn)物是腫瘤促進(jìn)因子，有致癌作用[4]。microRNA(miRNA)是真核生物中的一類非編碼單鏈RNA分子，也是近年來發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)工具，通過參與轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)的調(diào)控來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程。有研究顯示，miRNA與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在特定情況下可扮演癌基因或抑癌基因的角色[5]。miRNA-92a(miR-92a)屬于miRNA-17-92家族，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中多發(fā)揮癌基因的作用[6]。人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(PVT1 )是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)，其在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而且其表達(dá)水平與患者的臨床病理特征有明顯相關(guān)性[7]。雖然胃癌組織中p53、PVT1基因和miR-92a表達(dá)情況及其與患者病理特征之間的關(guān)系已有研究，但評估三者血清水平在胃癌預(yù)后中的價(jià)值研究很少。本研究旨在探討血清抑癌基因p53、PVT1和miR-92a檢測在胃癌患者預(yù)后評估中的價(jià)值，以期為患者的預(yù)后評估和臨床治療方案的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2017年7月在本院接受治療的148例行胃癌根治術(shù)的胃癌患者和136例慢性萎縮性胃炎患者分別作為胃癌組、良性病變組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均表現(xiàn)出不同程度的腹脹、腹痛、惡心、噯氣、反酸、嘔吐、消瘦等癥狀；(2)有完整的病歷和隨訪資料；(3)經(jīng)胃鏡檢查或病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有胃手術(shù)史；(2)長期酗酒；(3)患有免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，或患有影響腫瘤標(biāo)志物檢測的相關(guān)疾??；(4)正在服用免疫抑制劑、非甾體類藥物、激素等藥物；(5)正在接受放化療、免疫治療；(6)近2周內(nèi)服用過抗幽門螺桿菌藥物，包括抗菌藥物、質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑等；(7)胃癌根治術(shù)后3個月內(nèi)死亡。另選取同期60例體檢健康者作為健康對照組。胃癌組中男112例，女36例；年齡25～84歲，平均(58.47±12.95)歲。良性病變組中男106例，女30例；年齡24～85歲，平均(58.05±12.17)歲。健康對照組中男46例，女14例；年齡24～84歲，平均(57.87±12.13)歲。3組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 RNA提取Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA酶抑制劑RNasin購自日本Toyobo公司，Oligo-dT18試劑盒購自北京賽百盛生物工程公司，SYBR Green 實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自美國Stratagene公司，PCR Master Mix、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA純化試劑盒購自美國Promega公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國MJ Research公司，島津UV-2201型紫外分光光度計(jì)購自日本島津公司，ABI Veriti梯度PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3檢測方法 采集每例研究對象血漿2 mL，置于-80 ℃冰箱中凍存待測。按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對RNA提取液的吸光度值(A260)進(jìn)行檢測，計(jì)算濃度和純度，在瓊脂糖凝膠中電泳，檢測RNA完整性。按照MMLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存。實(shí)時熒光定量PCR檢測p53、PVT1和miR-92a的表達(dá)。建立實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，上游引物：5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′； PVT1上游引物：5′-CATCCGGCGCTCAGCT-3′，下游引物：5′-TCATGATGGCTGTATGTGCCA-3′；miR-92a引物序列：5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTG-3′；p53上游引物：5′-GCTGAGTATCTGGACGACA-3′，下游引物：5′-CAGGCACAAACACGAACC-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計(jì)32個循環(huán)。用2%瓊脂糖凝膠電泳及溶解曲線分離PCR產(chǎn)物。應(yīng)用Tanon2500凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，用目的基因A值與內(nèi)參基因A值的比值表示目的基因miRNA的相對表達(dá)水平。

1.4術(shù)后隨訪 通過電話、門診等方式對胃癌患者進(jìn)行隨訪，從手術(shù)日期開始，術(shù)后2年內(nèi)每3個月隨訪1次，第3年開始每3個月隨訪1次，第5年開始每年隨訪1次，隨訪截止時間為2020年8月5日，隨訪內(nèi)容為詢問患者病情，復(fù)查胃鏡、腹部B超、胸部X線片、大便隱血試驗(yàn)等?？偵鏁r間為手術(shù)日期至死亡或隨訪截止日期。

2 結(jié) 果

2.13組間外周血p53、PVT1和miR-92a表達(dá)水平比較 胃癌組血清p53、PVT1和miR-92a相對表達(dá)水平明顯高于良性病變組和健康對照組，良性病變組也明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組間外周血p53、PVT1和miR-92a相對表達(dá)水平比較

2.2最佳截?cái)嘀荡_定 根據(jù)ROC曲線選取外周血p53、PVT1和miR-92a表達(dá)的最佳截?cái)嘀怠53最佳截?cái)嘀禐?.50，靈敏度為0.772，特異度為0.631；PVT1最佳截?cái)嘀禐?.95，靈敏度為0.719，特異度為0.585；miR-92a最佳截?cái)嘀禐?.78，靈敏度為0.790，特異度為0.624。

2.33項(xiàng)指標(biāo)與胃癌患者性別、年齡、臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)ROC曲線確定的最佳截?cái)嘀?，?48例胃癌患者分為p53高表達(dá)組(n=77)、p53低表達(dá)組(n=71)，PVT1高表達(dá)組(n=80)、PVT1低表達(dá)組(n=68)，miR-92a高表達(dá)組(n=72)、miR-92a低表達(dá)組(n=76)。不同性別、N分期胃癌患者外周血PVT1表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同腫瘤分化程度胃癌患者外周血p53表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同TNM分期胃癌患者miR-92a表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3項(xiàng)指標(biāo)與胃癌患者性別、年齡臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4預(yù)后分析 148例胃癌患者的中位生存時間為46個月(4～135個月)。截至2020年8月5日，死亡104例(70.27%)，存活44例(29.73%)。比較不同性別、年齡、臨床病理特征患者的中位生存時間顯示，p53、PVT1和miR-92a表達(dá)水平低者的中位生存時間均明顯長于表達(dá)水平高者，腫瘤最大徑<4.25 cm、TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期和血小板計(jì)數(shù)<221.5×109/L者的中位生存時間也明顯長于腫瘤最大徑≥4.25 cm、TNM分期Ⅲ期和血小板計(jì)數(shù)≥221.5×109/L者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 148例胃癌患者的預(yù)后分析

續(xù)表3 148例胃癌患者的預(yù)后分析

2.5預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析 單因素分析顯示，血小板計(jì)數(shù)、腫瘤最大徑≥4.25 cm、TNM分期Ⅲ期及血清p53≥0.50、PVT1≥0.95和miR-92a≥1.78均為影響胃癌患者預(yù)后的因素(P<0.05)。將上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床因素納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤最大徑、TNM分期及血清p53、PVT1和miR-92a表達(dá)均是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

2.6ROC曲線分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，p53、PVT1、miR-92a及三者聯(lián)合檢測對判斷胃癌患者預(yù)后的AUC(95%CI)分別為0.593(0.521～0.667)、0.603(0.519～0.675)、0.627(0.524～0.693)、0.882(0.327～0.934)，miR-92a單獨(dú)檢測對判斷胃癌患者預(yù)后的AUC明顯高于PVT1、p53單獨(dú)檢測，三者聯(lián)合檢測對判斷胃癌患者預(yù)后的AUC明顯高于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 148例胃癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，腫瘤最大徑、TNM分期及血清p53、PVT1和miR-92a表達(dá)均是影響胃癌患者預(yù)后的因素。腫瘤最大徑對胃癌的發(fā)展和患者預(yù)后有重要影響，原因主要與病灶大小、病理分化程度、腫瘤浸潤深度和腫瘤侵犯鄰近臟器范圍等有關(guān)[8]。TNM分期是由國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的統(tǒng)一國際分期標(biāo)準(zhǔn)，是反映胃癌進(jìn)展情況、局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一種簡潔方法。TNM分期系統(tǒng)中，腫瘤侵犯深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目都是判斷胃癌患者預(yù)后的決定因素，綜合二者來判斷腫瘤分期可用于預(yù)后指導(dǎo)，能更準(zhǔn)確地反映腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后情況。隨著影像學(xué)技術(shù)、病理診斷技術(shù)等的不斷發(fā)展，胃癌TNM分期系統(tǒng)近年來得到不斷更新和完善，新的胃癌分期系統(tǒng)更合理，更加細(xì)化，這使得個體化差異也更明顯，在判斷患者預(yù)后方面發(fā)揮的作用也更明顯[9]。盡管腫瘤最大徑、TNM分期對判斷患者預(yù)后有重要臨床意義，但其結(jié)果均在胃癌根治術(shù)后才能獲得，在減少術(shù)后胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及降低患者病死率方面應(yīng)用價(jià)值較低。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因?qū)W研究的進(jìn)展，使得依靠分子生物學(xué)對胃癌進(jìn)行預(yù)后判斷和對其生物學(xué)特征的進(jìn)一步了解成為可能，這對于提高早期胃癌診斷水平、準(zhǔn)確評估其惡性程度和判斷預(yù)后有重要價(jià)值。

p53基因是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)程度最高且研究最為廣泛的基因，由10個內(nèi)含子和11個外顯子組成。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，p53蛋白能引起腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是一種腫瘤促進(jìn)因子，而其是p53基因突變的產(chǎn)物，抑癌基因野生型p53基因失活在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。正常p53蛋白是一種細(xì)胞周期中增殖細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，能通過控制G0～G1期細(xì)胞進(jìn)入S期而抑制細(xì)胞增殖，發(fā)生突變的p53基因會影響穩(wěn)定蛋白抑制細(xì)胞增殖的作用，令腫瘤更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。有研究指出，p53基因的過表達(dá)在胃癌發(fā)生過程中起著非常重要的作用，其與胃癌的轉(zhuǎn)移、浸潤和預(yù)后均密切相關(guān)，其表達(dá)水平升高可能提示腫瘤有較高的深部浸潤傾向和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力，從而可導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良[10]。本研究結(jié)果顯示，p53高表達(dá)者的預(yù)后相比低表達(dá)者更差，這與上述以往研究結(jié)果一致。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄長度>200個核苷酸的RNA，無編碼蛋白質(zhì)的作用，但其多態(tài)性或表達(dá)異常與多種人類疾病有關(guān)。PVT1是一種重要的lncRNA，已經(jīng)證實(shí)PVT1在包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種人類腫瘤中呈高表達(dá)，而且與腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后關(guān)系密切，被認(rèn)為是一種促癌性的lncRNA[6]。本研究結(jié)果也顯示，胃癌患者外周血PVT1表達(dá)水平較健康對照者和胃良性病變者均明顯升高，而且胃癌患者中，PVT1高表達(dá)者的預(yù)后較低表達(dá)者更差，其是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。PVT1表達(dá)升高影響胃癌患者預(yù)后的機(jī)制可能在于：(1)腫瘤細(xì)胞的PVT1高表達(dá)與原癌基因Myc miRNA表達(dá)密切相關(guān)，二者可共同擴(kuò)增腫瘤，協(xié)同促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)展。(2)PVT1可作為一種競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)與miRNA互相調(diào)控，影響細(xì)胞增殖和凋亡[11]。也有研究指出，PVT1過表達(dá)可減少miR-1204的生成，后者具有促進(jìn)抗凋亡基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用[12]。此外，PVT1還可能通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路的活化來抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。miR-92a定位于人基因組第13號染色體上，是由高度保守的miR-17-92基因簇編碼的一種miRNA，研究發(fā)現(xiàn)其在人類多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)出過表達(dá)的狀態(tài)。miR-17-92基因簇是潛在的致癌基因，這個基因簇中包括的miRNAs在多種腫瘤中的表達(dá)水平均升高，包括來自結(jié)腸、乳腺、胰腺、肺、胃、前列腺等的實(shí)體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其很可能參與了胃癌的調(diào)控，其中miR-92a被認(rèn)為是非常重要的調(diào)控胃癌發(fā)生、發(fā)展的因子[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a在胃癌組織中高表達(dá)，采用miR-92a反義寡核苷酸(ASO)轉(zhuǎn)染的人胃癌SGC-7901細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡征象，因此其被指出具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用[14]。還有研究指出，敲除miR-92a基因的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡得到明顯促進(jìn)，其進(jìn)一步證實(shí)miR-92a可通過抑制其靶基因Bim的表達(dá)來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，外周血miR-92a表達(dá)與胃癌患者TNM分期有關(guān)，是影響胃癌患者預(yù)后的因素，高miR-92a表達(dá)水平的胃癌患者預(yù)后不良。筆者推測miR-92a具有癌基因作用，其可通過對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控影響患者預(yù)后，但其具體的生物學(xué)機(jī)制還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

此外，本研究通過ROC曲線分析確認(rèn)了外周血p53、PVT1、miR-92a表達(dá)在胃癌患者預(yù)后評估中的價(jià)值，結(jié)果顯示miR-92a單獨(dú)檢測對判斷胃癌患者預(yù)后的AUC為0.627，明顯高于PVT1、p53單獨(dú)檢測，聯(lián)合檢測判斷患者預(yù)后的AUC為0.882，相比單獨(dú)檢測更高，這提示3項(xiàng)指標(biāo)在胃癌患者預(yù)后評估中均存在一定價(jià)值，這3項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測較單獨(dú)檢測具有更理想的預(yù)測價(jià)值，有望成為一種新的判斷胃癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，胃癌患者外周血p53、PVT1和miR-92a呈現(xiàn)高表達(dá)，且三者表達(dá)水平升高均是影響患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。p53、PVT1和miR-92a聯(lián)合檢測對胃癌患者預(yù)后有一定的預(yù)測價(jià)值。