miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌中的表達及臨床意義*

祝金波，王 敏，周 林，劉毓玲

湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430050

腎細胞癌是起源于腎實質(zhì)腎小管上皮的惡性腫瘤，其中透明細胞癌是最常見且惡性程度最高的類型，透明細胞癌患者極易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，導致患者預后差[1-2]。腎細胞癌的早期癥狀不明顯，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，腎細胞癌采用放療、化療治療效果均不佳[3]。腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個極其復雜的動態(tài)過程，具體機制尚不清楚，目前臨床尚未發(fā)現(xiàn)能對其進行早期診斷及預后判斷的特異性指標，因此，尋找早期診斷及治療的靶標是腎細胞癌研究領(lǐng)域的熱點。近些年研究人員發(fā)現(xiàn)微小RNAs(miRNAs)在腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用[4-5]。miRNAs是長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，它與生物體的細胞分化、發(fā)育、增殖、凋亡等多種生物學過程關(guān)系密切[6]。多項研究顯示，在腎細胞癌組織中能檢測到異常表達的miRNAs，miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用[7-9]。本研究分析miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌與癌旁組織中的表達差異，及其與病理分期、臨床分期等之間的關(guān)系，旨在為腎細胞癌的早期診斷、治療、預后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年2月至2019年2月46例在本院泌尿外科行腎臟切除術(shù)患者的腎細胞癌組織及其癌旁組織(距癌組織5 cm以上)，并保存于液氮中。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診為腎細胞癌，且癌旁組織無癌組織浸潤。46例患者中男32例，女14例；年齡25～70歲，平均(53.2±14.6)歲。組織學類型的分類采用世界衛(wèi)生組織2004年腎細胞癌的病理分類標準，臨床分期采用2009年國際抗癌組織和美國癌癥聯(lián)合會的臨床分期標準。TNM分期：T1期26例，T2期17例，T3期2例，T4期1例。臨床分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期17例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 PRISM7000實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；UV-2006型紫外分光光度計(日本島津公司)。RNA提取試劑為Trizol試劑(美國invitrogen公司)；miRNA專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒及miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司)；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取 采用液氮研磨法將組織磨成粉末，嚴格按照說明書的步驟加入Trizol試劑提取研磨后標本中的總RNA，使用紫外分光光度計檢測其水平，記錄吸光度值(A260)，所提取總RNA放置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 按照miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟操作。取1 μL總RNA加入20 μL反應體系中，在PRISM7000實時熒光定量PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，將反應體系設(shè)置為37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，合成cDNA，稀釋10倍后放置于—20 ℃保存待測。以U6 snRNA作為內(nèi)參，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。樣品目的基因相對表達水平采用ΔΔCT方法計算，其中相對表達水平=2-ΔΔCT。

1.4觀察指標 比較miR-122和miR-144-3p在癌組織與癌旁組織中的差異。 以腎細胞癌組織中miR-122、miR-144-3p的表達水平平均值作為分界，將46例患者分為miR-122低表達和miR-122高表達、miR-144-3p低表達和miR-144-3p高表達，并分析不同年齡、性別、臨床病理特征患者中miR-122和miR-144-3p的表達情況。

表1 RT-qPCR特異性引物

2 結(jié) 果

2.1癌組織和癌旁組織中miR-122和miR-144-3p的表達情況 miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌患者癌組織和癌旁組織中的相對表達水平見表2，miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌患者癌組織中的相對表達水平均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 miR-122和miR-144-3p表達水平比較

2.2不同特征患者 miR-122在癌組織中的表達情況 不同年齡、性別患者miR-122低表達和miR-122高表達百分率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同TNM分期、臨床分期患者miR-122低表達和miR-122高表達百分率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同特征患者 miR-122在癌組織中的表達情況[n(%)]

2.3不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達情況 不同年齡、性別患者miR-144-3p低表達和miR-144-3p高表達百分率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同TNM分期、臨床分期患者miR-144-3p低表達和miR-144-3p高表達百分率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達情況[n(%)]

續(xù)表4 不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達情況[n(%)]

3 討 論

腎細胞癌是我國目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，其起病較隱匿，早期臨床癥狀不明顯，因此早期診斷困難，且患者預后不佳，存活患者生活質(zhì)量差。近年來，生物標志物的研究成為熱點，為了改進臨床診斷策略，提高疾病的治療效果，篩選新的腎細胞癌生物標志物作為治療靶點引起了重視。已有研究顯示，miRNAs以多種信號途徑參與了腎細胞癌的調(diào)控[10-12]。有研究表明，miRNA在腎細胞癌和其他人類惡性腫瘤中起著重要作用，腎細胞癌組織中也存在miRNA表達的異常[13-14]，本研究對新的腎細胞癌標志物miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌中的表達及臨床意義進行探討，以期為腎細胞癌的臨床診斷提供新的思路和參考。

以往研究顯示，盡管大部分miRNAs在腎細胞癌中表達下調(diào)[15-16]，但是還是存在一些miRNAs的表達上調(diào)，如在腎細胞癌中miR-122的表達水平明顯上調(diào)[17]。作為一種特異性miRNAs，miR-122在脂肪和膽固醇代謝中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，與癌旁組織相比，腎細胞癌組織中的miR-122表達上調(diào)，并且腎細胞癌組織中的miR-122水平與預后密切相關(guān)[18-21]。miRNA參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，miR-144位于染色體17q11.2，具有miR-144-3p和miR-144-5p兩種形式[22]。miR-144-3p可參與多種癌細胞的增殖、分化過程，能夠促進肺癌細胞、肝癌細胞和膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移，發(fā)揮促癌基因的作用[23-25]。邱彬[26]的研究顯示，在裸鼠體內(nèi)miR-144-3p能促進腎細胞癌的腫瘤形成和生長，在腎細胞癌的發(fā)病機制中起重要作用。樓寧[27]的研究也顯示，miR-144-3p在腎透明細胞癌組織中的表達水平明顯高于正常組織。

本研究結(jié)果顯示，miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌患者癌組織中的相對表達水平均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腎細胞癌組織中miR-122和miR-144-3p表達水平的高低與TNM分期、臨床分期關(guān)系密切，提示miR-122和miR-144-3p可能在腎細胞癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

本研究為miR-122和miR-144-3p在腎細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的機制研究提供了新的思路和參考，miR-122和miR-144-3p有望成為腎細胞癌早期診斷和預后判斷的新標志物。