木香烴內(nèi)酯對(duì)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化的影響

任 莉，李慧敏，高玉海，吳思敏，陳克明

由于人口結(jié)構(gòu)的變化和預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，骨疾病尤其是骨質(zhì)疏松癥變得越來(lái)越普遍。2016年中國(guó)60歲以上的老年人骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)36%，說(shuō)明骨質(zhì)疏松癥已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能，能促進(jìn)骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等間充質(zhì)組織的再生[2]。因此，如能有效促進(jìn)BMSCs成骨性分化就有可能增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和增強(qiáng)其活性，從而加速骨骼形成。而藥物可通過(guò)上述過(guò)程促進(jìn)骨吸收，達(dá)到減緩骨質(zhì)疏松的效果。木香烴內(nèi)酯是從傳統(tǒng)中藥木香中提取的一種倍半萜內(nèi)酯，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗真菌、抗癌等多種生物活性[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs成骨性分化的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 木香烴內(nèi)酯購(gòu)自寶雞辰光有限公司，純度>98%。SPF級(jí)SD大鼠，甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK(甘)2009-0006-152。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原代大鼠BMSCs分離培養(yǎng)：取80～120 g SD大鼠4只，原代大鼠BMSCs分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[4-5]。脫頸處死大鼠后75%乙醇浸泡15 min，無(wú)菌條件下剝離出股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，并用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基完全沖出骨髓，直至骨髓腔變白，合并沖出液，反復(fù)吹打，使細(xì)胞團(tuán)塊盡量打散。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3 d，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2遍，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液1次，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%～90%時(shí)行成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)條件為10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L L-抗壞血酸。

1.2.2成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)：原代細(xì)胞首次換液后用10-6mol/L木香烴內(nèi)酯培養(yǎng)(木香烴內(nèi)酯組)，對(duì)照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)木香烴內(nèi)酯載體溶液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合為80%～90%時(shí)行成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)成骨性分化相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：將傳至第3代的大鼠BMSCs接種于12孔板中，然后使用10-5～10-8mol/L木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行干預(yù)(每種濃度6孔)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合為80%～90%時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)劑行成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)。通常9 d后ALP活性達(dá)峰值，通過(guò)比較不同濃度木香烴內(nèi)酯干預(yù)后ALP活性來(lái)確定木香烴內(nèi)酯的最佳作用濃度。

1.2.4茜素紅染色：原代細(xì)胞以每孔2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)液中含10%胎牛血清。于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第12天，采用茜素紅染色法行鈣化結(jié)節(jié)組織化學(xué)染色。PBS液洗滌后，10%甲醛固定10 min。加入茜素紅染色劑，37℃孵育30 min，觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.2.5BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達(dá)：BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物由上海百賽公司設(shè)計(jì)并合成。于木香烴內(nèi)酯干預(yù)24 h后，采用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件均參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定。RT-PCR數(shù)據(jù)采用ΔΔCt處理，實(shí)驗(yàn)使用GAPDH為對(duì)照基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用2-ΔΔCt表示結(jié)果，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。引物序列見(jiàn)表1。

表1 BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物序列

1.2.6BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)：將原代大鼠BMSCs接種培養(yǎng),首次換液后用木香烴內(nèi)酯10-6mol/L培養(yǎng)(木香烴內(nèi)酯組)，對(duì)照組加入等體積DMSO木香烴內(nèi)酯載體溶液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合為80%～90%時(shí)加入成骨性誘導(dǎo)劑行成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)，48 h后采用Western blot法檢測(cè)成骨活性相關(guān)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 鏡下觀察，培養(yǎng)初期大鼠BMSCs以梭形為主(圖1A，×10)，形成單細(xì)胞克隆(圖1B，×4)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞體積增大(圖1C，×10)，誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d左右出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)(圖1D，×10)。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs的最佳作用濃度 對(duì)照組ALP活性為31 U/gprot，10-5～10-8mol/L木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠BMSCs 9 d后，ALP活性分別為26、41、37、33 U/gprot。因此10-6mol/L為木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs的最佳作用濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此濃度。不同濃度木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠BMSCs 9 d后ALP活性見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞9 d后堿性磷酸酶活性變化情況

2.3茜素紅染色結(jié)果 BMSCs經(jīng)木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目多于對(duì)照組(P<0.01)。茜素紅染色結(jié)果見(jiàn)圖3，鈣化結(jié)節(jié)陽(yáng)性克隆統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后鈣化結(jié)節(jié)陽(yáng)性克隆統(tǒng)計(jì)

圖3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后茜素紅染色

2.4木香烴內(nèi)酯對(duì)BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達(dá)的影響 木香烴內(nèi)酯組BMP-2、RUNX-2及CollagenⅠ mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達(dá)的影響

2.5木香烴內(nèi)酯對(duì)BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響 木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠BMSCs 48 h后采用Western blot法檢測(cè)成骨活性相關(guān)蛋白表達(dá)情況，木香烴內(nèi)酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。見(jiàn)圖6。

圖6 木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥主要是由于骨代謝過(guò)程中骨形成和骨吸收失衡所致，BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致骨形成減少[7]，而B(niǎo)MSCs具有多向分化潛能，可在不同微環(huán)境下定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，具有良好的應(yīng)用前景[8-10]。另有研究報(bào)道，云木香具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗真菌等多種生物活性[3]?？鼓[瘤是木香烴內(nèi)酯的主要藥理活性[11]。本研究以大鼠BMSCs為對(duì)象，用木香烴內(nèi)酯進(jìn)行干預(yù)，研究木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs的影響。結(jié)果顯示，10-6mol/L為木香烴內(nèi)酯提高大鼠BMSCs成骨性分化的最佳作用濃度，而10-5mol/L的木香烴內(nèi)酯可抑制ALP活性，說(shuō)明木香烴內(nèi)酯對(duì)BMSCs成骨性分化存在濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)還經(jīng)檢測(cè)ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)染色和成骨活性相關(guān)蛋白、基因表達(dá)，明確木香烴內(nèi)酯對(duì)大鼠BMSCs成骨性分化的影響。

BMSCs在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。木香烴內(nèi)酯是中藥木香的主要有效成分，是一種倍半萜內(nèi)酯類化合物。木香烴內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)中包含α-亞甲基-γ-內(nèi)酯環(huán)，該結(jié)構(gòu)能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而干擾細(xì)胞的代謝過(guò)程，從而發(fā)揮多種藥理活性[13]。但目前關(guān)于木香烴內(nèi)酯影響B(tài)MSCs成骨性分化的報(bào)道還較少。ALP是成骨細(xì)胞前體成骨性分化的重要標(biāo)志物[14]，因此本文從ALP活性水平篩選木香烴內(nèi)酯的最佳作用濃度，結(jié)果顯示不同濃度木香烴內(nèi)酯作用BMSCs 9 d后，測(cè)定ALP活性發(fā)現(xiàn)，除10-5mol/L木香烴內(nèi)酯對(duì)ALP活性產(chǎn)生抑制作用外，其余濃度(10-6、10-7、10-8mol/L)木香烴內(nèi)酯干預(yù)大鼠BMSCs的ALP活性均高于對(duì)照組，且10-6mol/L木香烴內(nèi)酯干預(yù)后的ALP活性最高。鈣化結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)，相較對(duì)照組，木香烴內(nèi)酯組BMSCs茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)陽(yáng)性克隆更加密集，顏色也更深。這些結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯能促進(jìn)大鼠BMSCs成骨性分化。木香烴內(nèi)酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組；BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白是成骨細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，木香烴內(nèi)酯組BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明木香烴內(nèi)酯可促進(jìn)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

綜上，木香烴內(nèi)酯能誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化，且濃度為10-6mol/L時(shí)誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。