sRAGE通過(guò)一氧化氮途徑抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠變應(yīng)性鼻炎

隋利萍, 李清華, 李 健, 趙運(yùn)華, 郭有新, 鄭家華

(河北省承德市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

世界上大約有5億人患有過(guò)敏性鼻炎，這導(dǎo)致成人和兒童的生活質(zhì)量下降，不僅在身體方面，而且在心理功能方面，增加了社會(huì)開(kāi)支[1]。過(guò)敏反應(yīng)的特征包含抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)的產(chǎn)生；輔助性T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞增多；過(guò)敏介質(zhì)的釋放等。目前，該病的治療包括避免過(guò)敏原和藥物，包括皮質(zhì)類固醇、抗組胺藥、抗膽堿藥、減充血?jiǎng)?、白三烯受體拮抗劑、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑和免疫治療，這些藥物大多會(huì)引起各種副作用[2]。研究表明，sRAGE可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RAGE而抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]。一氧化氮(NO)是一種信號(hào)分子，由精氨酸產(chǎn)生，具有多種生理功能。變應(yīng)性鼻炎患者鼻內(nèi)NO濃度升高。既往研究顯示，高膽固醇患者配體-RAGE軸的激活可增加NO的合成[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討sRAGE在小鼠變應(yīng)性鼻炎模型中的作用及一氧化氮途徑的作用。

1 材料與方法

1.1材料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；離心機(jī)(Medifuge公司，意大利)；卵清蛋白，一種用于觸發(fā)T細(xì)胞活化的藥物(Sigma，美國(guó))；Al(OH)3[氫氧化鋁](Sigma，美國(guó))；sRAGE購(gòu)自北京愛(ài)迪博生物科技有限公司；一抗(iNOS,β-actin)購(gòu)自Abcam公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、一步法實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組:選擇Balb/c小鼠(8周齡，雌性)，體重為20～22g。隨機(jī)分為三組，每組6只，分別為對(duì)照組(n=6)，變應(yīng)性鼻炎組(n=6)，sRAGE干預(yù)的變應(yīng)性鼻炎組(n=6)。變應(yīng)性鼻炎組分別于第1、5、14、21天腹腔注射卵清蛋白40μg/kg和氫氧化鋁40mg/kg致敏小鼠，然后通過(guò)鼻腔給藥25mg/mL的20μL卵清蛋白激發(fā)14d。sRAGE干預(yù)的變應(yīng)性鼻炎組，在小鼠第一次腹腔注射卵清蛋白前12h腹腔注射sRAGE，100μg/只，每12h注射一次，至最后一次滴鼻完成，余同變應(yīng)性鼻炎組。對(duì)照組腹腔注射及滴鼻同等劑量的生理鹽水。

1.3鼻部抓撓行為評(píng)價(jià):最后一次鼻腔激發(fā)后，立即記錄每只小鼠10min，以評(píng)估其鼻部抓撓行為。然后，用氯胺酮(80mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(10mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，采集血樣，摘除鼻腔。

1.4實(shí)時(shí)定量qRT-PCR:用TRIzol試劑(Invitrogen)從骨組織中分離總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，測(cè)量了260nm處的吸光率和260/280nm的吸光率(Eppendorf，德國(guó))。然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物

1.5一氧化氮合酶蛋白表達(dá)測(cè)定：我們應(yīng)用Westernblot測(cè)量小鼠鼻組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表達(dá)。用RIPA裂解液和PMSF溶解鼻黏膜組織。用SDS-PAGE法從各組鼻黏膜中分離出50～60μg總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉細(xì)胞膜，然后用抗iNOS(1∶1000；Abcam)、β-actin(1∶1000；Abcam)的一抗孵育。用TBST洗滌后，用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗(1∶3000)孵育膜，并用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ChampChemi；SAGECREATION，北京)觀察免疫印跡并拍照，灰度值圖像J(NIH，Bethesda，MD)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1sRAGE對(duì)卵清蛋白致小鼠變應(yīng)性鼻炎鼻抓撓行為的影響:圖1顯示了卵清蛋白、氫氧化鋁和sRAGE對(duì)小鼠鼻抓撓行為的影響。與對(duì)照組相比，變應(yīng)性鼻炎組的鼻抓撓次數(shù)明顯增多(P<0.05)。與變應(yīng)性鼻炎組相比，sRAGE干預(yù)組的鼻抓撓次數(shù)明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 sRAGE阻斷卵清蛋白、氫氧化鋁誘導(dǎo)的雌性balb/c小鼠過(guò)敏反應(yīng)

2.2sRAGE對(duì)卵清蛋白致小鼠變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜組織中IL-4和IFN-γ基因水平的影響:圖2，3顯示了sRAGE對(duì)各組小鼠鼻黏膜組織中IL-4和IFN-γ基因水平的影響。與對(duì)照組相比，變應(yīng)性鼻炎組的IL-4 mRNA水平明顯升高，IFN-γ mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與變應(yīng)性鼻炎組相比，sRAGE干預(yù)組的IL-4 mRNA水平明顯降低，IFN-γ mRNA水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。

圖2 sRAGE降低卵清蛋白、氫氧化鋁誘導(dǎo)的小鼠鼻黏膜組織中IL-4的mRNA水平

圖3 sRAGE升高卵清蛋白、氫氧化鋁誘導(dǎo)的小鼠鼻黏膜組織中IFN-γ的mRNA水平

2.3sRAGE對(duì)卵清蛋白致小鼠變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平的影響：圖4顯示了sRAGE對(duì)各組小鼠鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平的影響。與對(duì)照組相比，變應(yīng)性鼻炎組的iNOS蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與變應(yīng)性鼻炎組相比，sRAGE干預(yù)組的iNOS蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 sRAGE降低卵清蛋白、氫氧化鋁誘導(dǎo)的小鼠鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究了sRAGE對(duì)卵清蛋白致小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的影響及一氧化氮的作用。sRAGE可降低致敏小鼠的鼻抓撓次數(shù)，提示sRAGE可阻斷卵清蛋白、氫氧化鋁誘導(dǎo)的雌性balb/c小鼠過(guò)敏反應(yīng)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，與變應(yīng)性鼻炎組相比，sRAGE干預(yù)組的IL-4 mRNA水平及iNOS蛋白水平明顯降低，IFN-γ mRNA水平明顯升高，提示sRAGE的抗過(guò)敏作用可能是通過(guò)炎癥反應(yīng)和一氧化氮途徑實(shí)現(xiàn)的。sRAGE可能減輕變應(yīng)性鼻炎鼻塞、頭痛等過(guò)敏癥狀。變應(yīng)性鼻炎可顯著降低個(gè)人生活質(zhì)量，嚴(yán)重影響社會(huì)開(kāi)支。過(guò)敏反應(yīng)最重要的部分是輔助性T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、IgE生成和過(guò)敏介質(zhì)釋放，這些都會(huì)導(dǎo)致受影響器官的急性功能改變[5]。

過(guò)敏性鼻炎中，一些介質(zhì)包括IgE、組胺、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CGRP、前列腺素、白細(xì)胞介素-1、類胰蛋白酶以及肥大細(xì)胞和一氧化氮的激活在過(guò)敏性鼻炎和偏頭痛中都很重要[6]。NO可引起神經(jīng)源性炎癥、血管擴(kuò)張血管通透性增高在變應(yīng)性鼻炎的病理生理學(xué)中有重要作用。大量證據(jù)表明NO血管舒張神經(jīng)傳遞途徑中起著重要作用[7]。鼻塞頭痛在過(guò)敏性鼻炎患者中很常見(jiàn)，IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合后，炎癥介質(zhì)的釋放可引起急性癥狀。肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的激活導(dǎo)致過(guò)敏性鼻炎患者的鼻塞頭痛。輔助性T細(xì)胞2(TH2)和輔助性T細(xì)胞1(TH1)之間的平衡在許多炎癥過(guò)程中起著重要作用，已知TH2細(xì)胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)參與過(guò)敏性炎癥,TH1細(xì)胞因子(包括IL-12和IFN-γ)可抑制TH2反應(yīng)，并在抑制過(guò)敏性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用[8]，在我們的研究中，sRAGE降低了血清IL-4水平，而增加了IFN-γ水平，從而逆轉(zhuǎn)了TH2/TH1介導(dǎo)的小鼠過(guò)敏。因此sRAGE可能減輕變應(yīng)性鼻炎的過(guò)敏癥狀。

一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶(NOS)的3種亞型[誘導(dǎo)型(iNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和神經(jīng)元型(nNOS)]產(chǎn)生的一種信號(hào)分子。以前的研究表明，iNOS產(chǎn)生的NO具有炎癥特性，而eNOS產(chǎn)生的NO具有抗炎作用[9]。在一些研究中，過(guò)敏患者的iNOS水平較高，但eNOS和nNOS與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異[10]。與上述文獻(xiàn)相似，在我們的實(shí)驗(yàn)中，sRAGE降低了小鼠過(guò)敏性鼻組織中iNOS的水平，從而降低了炎癥、過(guò)敏反應(yīng)。

綜上所述，sRAGE可通過(guò)一氧化氮途徑影響炎癥機(jī)制，從而消除過(guò)敏性鼻炎的癥狀，包括鼻搔癢行為、IL-4及IFN-γ水平的改變。