血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平與肝硬化、肝癌的相關(guān)性分析

楊 龍，彭 偉，張洪濤，查 元，師 婷，李 琳

原發(fā)性肝癌是臨床常見惡性腫瘤，早期無明顯癥狀體征，隨著病情發(fā)展可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、消化道癥狀及肝大等，惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，嚴重危及患者生命安全[1-3]。本病主要病因是病毒性肝炎及肝硬化，據(jù)統(tǒng)計在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中原發(fā)性肝癌發(fā)生率為10%～20%[4]。目前臨床常采用甲胎蛋白和超聲篩查早期肝癌，但前者靈敏度較低，后者對操作者經(jīng)驗水平要求較高[5]。病理檢查雖是診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但成本較高，可重復(fù)性較差，且具有一定創(chuàng)傷性[6]。因此尋找敏感性較高的預(yù)測指標(biāo)至關(guān)重要。近年來，炎癥體及下游炎性因子在肝硬化及肝癌中的作用備受關(guān)注，炎癥體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD樣受體及其形成的多蛋白水解復(fù)合物，在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[7]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是宿主先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與抵抗病原體。白細胞介素是由單核、巨噬及淋巴細胞分泌的炎性因子，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[8]。白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-1β(IL-1β)是NLRP3炎性小體分泌的炎性因子，其中IL-18可促進肥大細胞、T細胞及嗜酸粒細胞分泌Th2，增強免疫應(yīng)答；IL-1β可促進嗜酸粒細胞聚集，并維持相關(guān)細胞因子水平[9]。但目前肝硬化及肝癌發(fā)病過程中的細胞分子激活機制和炎癥激活后啟動組織細胞的損傷機制仍不清楚。為深入了解血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平與肝硬化、肝癌的關(guān)系，本研究檢測肝硬化、肝癌患者血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平，以期為臨床診斷提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月—2020年2月我院肝膽外科收治的70例肝硬化患者(肝硬化組)和60例肝癌患者(肝癌組)，另選取同期于我院體檢的50例健康者作為健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查或符合“原發(fā)性肝癌診療規(guī)范”[10]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝癌者；經(jīng)病理檢查或符合《慢性乙型肝炎防治指南》[11]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝硬化者；年齡30～75歲者；未經(jīng)手術(shù)及藥物治療者；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴重心、肺功能不全者；合并其他惡性腫瘤者；合并認知障礙者；臨床資料不完整者。肝硬化組中男40例，女30例；年齡31～74(50.06±6.28)歲；病程(4.78±0.60)年。肝癌組中男36例，女24例；年齡30～72(51.27±6.30)歲；病程(4.32±0.56)年。健康組中男31例，女19例；年齡30～75(50.06±6.28)歲。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2研究方法 采集3組患者空腹靜脈血4 ml，保存于EDTA抗凝管中待測。

1.2.1血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平測定：3000 r/min離心4 min，分離上清液后采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清NLRP3炎性小體、IL-18、IL-1β水平。

1.2.2NLRP3 mRNA表達量測定：肝素抗凝，離心分離出血清后采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測。加入淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞，加入1 ml Trizol混勻后按照說明書提取總RNA，加30 μl無RNA酶水溶解沉淀，得到RNA溶液。建立20 μl的反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，終止反應(yīng)。產(chǎn)物cDNA置于-20℃環(huán)境保存?zhèn)溆?。建?5 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，得到擴增曲線；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s后得到溶解曲線。每個標(biāo)本做復(fù)孔，Ct差值<0.5。

1.2.3肝功能指標(biāo)測定：采用羅氏全自動化學(xué)發(fā)光分析儀測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)水平。

1.2.4相關(guān)性分析：采用Spearman相關(guān)分析探討肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.13組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平比較 肝癌組和肝硬化組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平高于健康組，肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組和健康組血清IL-18水平低于肝硬化組，健康組血清IL-18水平高于肝癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平比較

2.23組肝功能指標(biāo)比較 肝癌組和肝硬化組ALT、TBIL、AST及GGT水平均顯著高于健康組，肝癌組ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組肝功能指標(biāo)比較

2.3肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，肝癌組NLRP3 mRNA表達量與ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)；血清IL-18水平與TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與ALT水平呈負相關(guān)(P<0.05)；血清IL-1β水平與TBIL、AST水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與ALT、GGT水平呈負相關(guān)(P<0.05)。見表3和圖1。

圖1 肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性散點圖

表3 肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-18、IL-1β水平與ALT、TBIL、AST及GGT的相關(guān)性

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，15%的腫瘤是由慢性感染性炎癥誘發(fā)，如慢性支氣管炎可增加患肺癌風(fēng)險；肝炎和肝硬化可增加患肝癌風(fēng)險[12]。HBV感染可致慢性肝臟炎癥，并誘發(fā)肝癌。報道顯示肝癌患者5年生存率約為50%[13]。故抑制慢性病毒性肝炎及肝硬化患者疾病進展對改善患者預(yù)后非常重要。

NLRP3炎性小體是大分子多蛋白復(fù)合體，NLRP3激活后可發(fā)生自身寡聚化，并在銜接蛋白ASC作用下形成NLRP3炎性復(fù)合體[14]，進而使pro-caspase-1剪切為有活性的caspe-1并切割其底物，以促進IL-1β、IL-18成熟，進而誘發(fā)炎性因子釋放[15-17]。同時炎性細胞可吞噬和凋亡肝臟上皮細胞，并損傷和破壞肝臟上皮細胞線粒體完整性，進而加速肝功能惡化[18]。IL-18是由活化巨噬細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子，可誘導(dǎo)免疫細胞增殖并增強其活性，促進多種細胞因子產(chǎn)生和分泌，同時也可致免疫損傷，使淋巴細胞數(shù)量上升，增強免疫防御效應(yīng)[19]。IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)功能的炎性因子，可促進T、B細胞活化、增殖及分化，同時可促進肝細胞生長因子合成，并誘導(dǎo)血管新生，上調(diào)COX-2表達，促使肝癌發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組和肝硬化組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平高于健康組，與董德嘉等[21]報道一致，說明肝硬化和肝癌患者體內(nèi)存在NLRP3、IL-1β分泌調(diào)節(jié)紊亂，分析原因可能為NLRP3、IL-1β均可激活T、B細胞激發(fā)自然殺傷和單核細胞活性，與抗原結(jié)合及病毒感染后可改變肝細胞膜成分，致肝細胞壞死及功能異常。而肝癌組血清IL-18水平低于健康組，提示肝癌患者IL-18水平下降可能與免疫功能下降有關(guān)，故提高血清IL-18水平可增強機體抗腫瘤免疫能力。且肝硬化組血清IL-18水平高于健康組，可能是因肝硬化患者肝細胞解毒功能和排泄能力下降導(dǎo)致IL-18無法正常代謝所致。同時本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平高于肝硬化組，提示NLRP3、IL-1β隨病情嚴重程度加重而升高，原因可能為NLRP3激活后可促進IL-1β分泌，進而損傷和破壞肝臟上皮細胞，加速肝功能惡化。不同的是，肝癌組IL-18低于肝硬化組，原因可能與炎癥反應(yīng)和免疫功能相關(guān)，因肝癌患者自身免疫防御效應(yīng)低下，致IL-18水平低表達，進一步說明NLRP3、IL-18、IL-1β水平與疾病進展具有相關(guān)性。

NLRP3為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3，IL-18為白細胞介素-18，IL-1β為白細胞介素-1β，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，TBIL為總膽紅素，AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GGT為谷氨酰轉(zhuǎn)移酶大多數(shù)肝病、肝損傷患者肝功能指標(biāo)升高，本研究結(jié)果顯示，肝癌組和肝硬化組ALT、TBIL、AST及GGT水平均顯著高于健康組，與謝梅和王芳[22]報道一致，說明肝炎病毒感染可導(dǎo)致肝功能異常，分析原因可能與宿主免疫損傷作用有關(guān)。有研究表明，AST、ALT、白蛋白與肝臟損傷程度有關(guān)[23]。本研究結(jié)果還顯示，肝癌組ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化組，提示ALT、TBIL、AST及GGT越高肝臟損害越嚴重。

與其他研究不同的是，本研究分析NLRP3、IL-18、IL-1β與肝功能的相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析顯示，肝癌組NLRP3 mRNA表達量與ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)；血清IL-18水平與TBIL、AST及GGT水平呈正相關(guān)，與ALT水平呈負相關(guān)；血清IL-1β水平與TBIL、AST水平呈正相關(guān)，與ALT、GGT水平呈負相關(guān)。提示血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝功能具有一定的相關(guān)性，可作為評估肝癌預(yù)后的有效指標(biāo)。但本研究納入對象數(shù)量較少，且為回顧性研究，結(jié)果可能存在一定偏倚，今后將擴大樣本量進行前瞻性研究，進一步分析血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝癌的相關(guān)性。

綜上所述，血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平與肝硬化進展存在相關(guān)性，NLRP3、IL-1β隨疾病嚴重程度而升高，病程進展至肝癌時IL-18表達降低。