松脂醇二葡萄糖苷促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨形成的作用研究

吳思敏，孫 薇，高玉海，任 莉，陳克明

[作者單位] 730050 蘭州，解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院骨科研究所(吳思敏、高玉海、任莉、陳克明)；610083 成都，西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科(孫薇)

骨質(zhì)疏松癥是一種嚴(yán)重的公共健康威脅，其患病率預(yù)計(jì)在未來幾十年內(nèi)急劇上升，主要威脅絕經(jīng)后婦女和老年人[1-2]。此外，全球范圍內(nèi)一項(xiàng)大型研究報(bào)道，普遍或偶發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折的年度總成本比率超過了許多其他嚴(yán)重慢性病[3-4]。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分[5]。杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎之功效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杜仲具有增加骨密度、改善骨小梁微結(jié)構(gòu)、抑制骨量減少和骨強(qiáng)度下降等作用，因此是很多治療骨質(zhì)疏松癥方劑的常用藥[7]?；诖它c(diǎn)，我們提出可將松脂醇二葡萄糖苷運(yùn)用于骨質(zhì)疏松癥的治療。本實(shí)驗(yàn)也表明適當(dāng)濃度的松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞的骨形成確有促進(jìn)作用，且進(jìn)一步表明其也可能具有抗骨質(zhì)疏松作用，但到目前為止關(guān)于松脂醇二葡萄糖苷抗骨質(zhì)疏松作用的研究還很少?，F(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取出生3 d內(nèi)的SPF級(jí)Wistar大鼠乳鼠，由解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所提供(合格證號(hào):SCXK甘2015-0002)。

1.2試劑和耗材 松脂醇二葡萄糖苷(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號(hào)：DST180313-013，純度98.85%)，二甲基亞砜(DMSO)制備松脂醇儲(chǔ)備液(濃度為0.1 mol/L)儲(chǔ)存在-20℃條件下，培養(yǎng)液中DMSO的最終濃度<5‰。α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)：2090463)；胎牛血清(Biological Industries公司，貨號(hào)：04-001-1A)；青鏈霉素混合液(Solarbio公司，貨號(hào)：P1400)；胰蛋白酶-EDTA溶液(Solarbio公司，貨號(hào)：T1300)；膠原酶Ⅱ(Solarbio公司，貨號(hào)：C8150)；高效RIPA裂解液(Solarbio公司，貨號(hào)：R0010)；地塞米松(Sigma公司，貨號(hào)：D1756)；L-抗壞血酸(Sigma公司，貨號(hào)：A7631)；β-甘油磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：D106347)；ECL Plus超敏發(fā)光液(Solarbio公司，貨號(hào)：PE0010)；RNAiso Plus[寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)：9109]；堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A059-1-1)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)：RR047A]；TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ[寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)：RR820A]；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio公司，貨號(hào)：PC0020)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒(Solarbio公司，貨號(hào)：P1200)；100、60 mm培養(yǎng)皿(Coring Costar公司，貨號(hào)：430167、430196)；35 mm培養(yǎng)皿(Thermo公司，貨號(hào)：150460)；6孔板(上海科進(jìn)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：10006)；96孔板(上海科進(jìn)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：10096)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Revco公司，型號(hào)：Forma371)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，型號(hào)：IX71)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Heraeus公司，型號(hào)：Primo R)；高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H1650R)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，型號(hào)：LD5-2A)；紫外分光光度計(jì)(惠普公司，型號(hào)：G1115A)；酶標(biāo)儀(Bio Tek公司，型號(hào)：EPOCH)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和濃度篩選：①細(xì)胞培養(yǎng)[8]：取出生3 d內(nèi)的SPF級(jí)Wistar大鼠乳鼠5只,置于75%乙醇中浸沒消毒處死。在無菌工作臺(tái)上分離出顱骨，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗，去除多余的結(jié)締組織。將顱骨剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃水浴中輕輕震蕩消化15 min，重復(fù)2次；棄胰蛋白酶消化液，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴中震蕩消化，重復(fù)4～5次。后將膠原酶上清消化液合并，用200目細(xì)胞篩過濾，收集濾液，室溫下1500 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，得到單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液調(diào)整至合適的密度轉(zhuǎn)入100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天更換培養(yǎng)液，之后每3天更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞增殖融合至90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②濃度篩選：將培養(yǎng)好的成骨細(xì)胞以2400/孔的密度接種于96孔板中，每孔加培養(yǎng)液100 μl于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)(一般為1 d后),棄去培養(yǎng)基，配置新的培養(yǎng)液，再將之前已制備好的松脂醇二葡萄糖苷儲(chǔ)備液按濃度由高到低依次添加培養(yǎng)液，使得細(xì)胞培養(yǎng)液中松脂醇二葡萄糖苷終濃度依次為0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L(每個(gè)濃度5孔)，再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d測(cè)定ALP活性。設(shè)置空白組及實(shí)驗(yàn)組，空白組中加入雙蒸水，實(shí)驗(yàn)組為加藥組。向上述各組中加入1︰1的緩沖液與基質(zhì)液，輕輕震蕩搖勻，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15 min；向孵育好的各組細(xì)胞中加入顯色液并即刻混勻置于酶標(biāo)儀上，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.3.2鈣化結(jié)節(jié)染色：將剛提取分離的成骨細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，3 d更換培養(yǎng)基1次。待成骨細(xì)胞融合>90%時(shí)進(jìn)行加藥處理，將培養(yǎng)基更換為含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，再加入合適濃度誘導(dǎo)劑β-甘油磷酸、L-抗壞血酸和地塞米松，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。顯微鏡下觀察細(xì)胞呈沙狀亮點(diǎn)聚集即為鈣化結(jié)節(jié)。棄去培養(yǎng)基，PBS液漂洗細(xì)胞3次；加入多聚甲醛固定液固定10 min，吸凈固定液后再用PBS液漂洗；加入適量茜素紅S染色液，37℃環(huán)境下避光孵育60 min，染色時(shí)間可根據(jù)肉眼觀察染色狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整；輕輕晃動(dòng)觀察，待皿底出現(xiàn)深紅色斑點(diǎn)時(shí)棄去染色液，PBS液漂洗至無多余染色液，顯微鏡下觀察并拍照保存染色結(jié)果。

1.3.3基因表達(dá)檢測(cè)：①收集細(xì)胞：將培養(yǎng)好的細(xì)胞按照適當(dāng)密度接種至60 mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS液洗滌3次，每皿加入適量的RNAiso Plus，冰浴裂解10 min后將細(xì)胞吹下收集在1.5 ml離心管中放于-80℃冰箱中備用。②RT-PCR分析：向上述融化的樣本中加入適量的三氯甲烷，12 000×g離心15 min。取上清再加入0.5倍體積的異丙醇，靜置30 min后12 000×g離心15 min。棄上清，保留離心管底部的白色沉淀，加入1 ml DEPC水配置的75%乙醇清洗沉淀2次，每次12 000×g離心15 min。棄上清，待離心管中的液體揮發(fā)完全后加入15～50 μl DEPC水溶解沉淀。按照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終得到的cDNA樣品放于-80℃冰箱中備用。再按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡ試劑盒說明操作。將混合好的PCR反應(yīng)液按分組加入八連管中置于qPCR儀中按說明書設(shè)置反應(yīng)條件。GAPDH作內(nèi)參基因校正結(jié)果。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列表

1.3.4蛋白表達(dá)檢測(cè)：將培養(yǎng)好經(jīng)過加藥處理的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去上清液，PBS液漂洗3次，加入適量的高效RIPA裂解液在搖床上冰浴裂解。裂解后13 000×g離心25 min，收集蛋白上清。應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品中的蛋白濃度，完成蛋白定量檢測(cè)后加熱變性。應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒配置分離膠和濃縮膠，待其完全凝固后上樣，通過電泳分離蛋白，然后按照相應(yīng)的分子量轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；轉(zhuǎn)移到含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h，按照抗體說明在相應(yīng)的一抗稀釋液中4℃孵育過夜；次日將PVDF膜復(fù)溫1 h，后用TBST洗滌5次，每次8 min。二抗1︰10 000稀釋，再按1︰10比例加入含5%脫脂奶粉的封閉液，室溫下?lián)u床孵育2 h，后用TBST洗滌4次，每次10 min。用ECL Plus超敏發(fā)光液在暗室中進(jìn)行顯色。利用Image J軟件掃描膠片，Adobe Photoshop CS5處理?xiàng)l帶。

2 結(jié)果

2.1對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響 松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細(xì)胞的最佳濃度為1×10-6mol/L(P<0.01)。見圖1。

2.2對(duì)鈣化結(jié)節(jié)的影響 濃度為1×10-6mol/L的松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細(xì)胞后,其鈣化結(jié)節(jié)形成程度明顯高于空白組。見圖2。

圖2 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響

2.3松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響 松脂醇二葡萄糖苷介導(dǎo)的BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達(dá)量均顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

圖3 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.4松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 松脂醇二葡萄糖苷處理后成骨細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白BMP-2、RUNX-2和OSX表達(dá)量均有所增加。見圖4。

圖4 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種與衰老相關(guān)的疾病，困擾著全球數(shù)百萬人[9]。隨著人們的壽命越來越長(zhǎng)，與壽命延長(zhǎng)相關(guān)的是各種低創(chuàng)傷性骨折發(fā)生率升高和其后果[10]。近年最被大眾所接受的骨質(zhì)疏松癥治療藥物為雙膦酸鹽，但雙膦酸鹽口服吸收性非常差[11]。近年人們對(duì)中草藥在骨質(zhì)疏松癥治療方面的功效產(chǎn)生了濃厚的興趣，中草藥成本低、易獲取、毒副作用小，或?qū)⒊蔀橹委煿琴|(zhì)疏松癥的重要方法。據(jù)報(bào)道杜仲能夠調(diào)節(jié)骨代謝，而松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明松脂醇二葡萄糖苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨性分化，因而有成為抗骨質(zhì)疏松新藥的潛力[12]。

ALP活性是成骨細(xì)胞早期成熟和分化的標(biāo)志，可反映骨形成狀況，其表達(dá)隨著細(xì)胞分化的成熟而增強(qiáng)。若一種藥物可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞ALP活性，說明其具有促進(jìn)骨形成的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)先以ALP活性為指標(biāo)檢測(cè)成骨細(xì)胞活性，結(jié)果表明，1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理后ALP活性最高。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞礦化機(jī)制形成的標(biāo)志。1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細(xì)胞后，鈣化結(jié)節(jié)形成顯著增多,明確了松脂醇二葡萄糖苷會(huì)影響成骨細(xì)胞骨形成。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了松脂醇二葡萄糖苷促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨形成過程中相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理可使成骨細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白基因BMP-2、RUNX-2與OSX表達(dá)水平顯著升高。眾所周知，OSX位于RUNX-2的下游，其蛋白表達(dá)量會(huì)根據(jù)RUNX-2的變化而變化。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)松脂醇二葡萄糖苷處理后，成骨細(xì)胞RUNX-2與OSX的變化確實(shí)一致。所以，松脂醇二葡萄糖苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。

綜上,1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷可促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠乳鼠顱骨成骨細(xì)胞骨形成，增加鈣化結(jié)節(jié)面積，并可升高成骨相關(guān)蛋白基因BMP-2、RUNX-2及OSX表達(dá)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。