脈沖群電磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖與礦化的影響

高玉海，何文芳，劉 菁，任 莉，吳思敏，陳克明

脈沖電磁場(chǎng)(PEMFs)為一種良好的生物物理治療方法，已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道了其具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與成熟礦化、增加青年大鼠峰值骨量、促進(jìn)骨折愈合的作用[1-3]。因PEMFs具有無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)感染、操作簡(jiǎn)單、無(wú)不良反應(yīng)等特點(diǎn)，近年有學(xué)者將其用于神經(jīng)修復(fù)、腰椎間盤(pán)突出癥治療等方面的研究[4-5]。脈沖群電磁場(chǎng)(PGEMFs)作為PEMFs的一種改良，作用效果如何尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。課題組前期已篩選出PEMFs促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與成熟礦化的最佳作用頻率、強(qiáng)度和時(shí)間，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其存在一定的不穩(wěn)定性。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察PGEMFs對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞(ROBs)增殖與礦化的影響，以期為增加骨形成提供新思路。

1 材料與方法

1.1PGEMFs發(fā)生裝置 PGEMFs電源由課題組聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院蘭州近代物理研究所電源室研發(fā)(尚未申請(qǐng)專(zhuān)利)。該電源能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖波、脈沖群波的穩(wěn)定輸出，通過(guò)連接計(jì)算機(jī)，運(yùn)用自主設(shè)計(jì)的控制軟件實(shí)現(xiàn)時(shí)間、頻率、強(qiáng)度及脈沖波與脈沖群波的不同比例混合等。電源連接線圈可產(chǎn)生一定范圍的均勻磁場(chǎng)，并能放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2儀器與試劑耗材 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Revco公司，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Heraeus公司，德國(guó))；高速冷凍離心機(jī)(湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，中國(guó))；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，中國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio Tek公司，美國(guó))；1000 ml、100 μl、10 μl移液槍(Eppendorf公司，德國(guó))。

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)：2090463)；胎牛血清(Lonsera公司，貨號(hào)：S711-001S)；青鏈霉素混合液(索萊寶公司，貨號(hào)：P1400)；胰蛋白酶-EDTA溶液(索萊寶公司，貨號(hào)：T1300)；Ⅱ型膠原酶(索萊寶公司，貨號(hào)：C8150)；地塞米松(Sigma公司，貨號(hào)：D1756)；維生素C(Sigma公司，貨號(hào)：A7631)；β-甘油磷酸(阿拉丁公司，貨號(hào)：D106347)；堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程有限公司，貨號(hào)：A059-1-1)；100 mm、60 mm培養(yǎng)皿(Coring Costar公司，貨號(hào)：430167/430196)；35 mm培養(yǎng)皿(Thermo公司，貨號(hào)：150460)；一次性移液管(科進(jìn)公司，貨號(hào)：1441)；1.5 ml離心管(科進(jìn)公司，貨號(hào)：2211S)；10 μl、100 μl、1000 μl槍頭(科進(jìn)公司，貨號(hào)：180805H、200592J、190498J)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠顱骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)：取出生48 h以內(nèi)的SPF級(jí)SD大鼠乳鼠(甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK-甘-2009-0006-152)，75%乙醇浸泡，無(wú)菌條件下取出顱骨，置入干凈的培養(yǎng)皿中，去除骨膜、血管及結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗2次。加入0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min，棄去消化液；再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化5次，每次12 min，收集并合并消化液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾。收集消化液，1000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)液懸浮，吹打均勻后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成骨性分化培養(yǎng)的條件為在原培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸1×10-2mol/L和維生素C 1×10-4mol/L。

1.3.2細(xì)胞增殖分析：將原代培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶消化懸浮后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104/ml,以每皿2 ml接種于60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組，每組3皿。對(duì)照組：將ROBs放入線圈內(nèi)90 min/d，但不通電；脈沖組：ROBs予50 Hz、0.6 mT、占空比為50%的PEMFS處理90 min/d；脈沖群組：ROBs予主脈沖頻率10 Hz、子脈沖頻率500 Hz、0.6 mT的PEMFs處理90 min/d。磁場(chǎng)處理完畢后，換含0.5% MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜震蕩至紫紅色結(jié)晶全部溶解，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)。

1.3.3成骨性分化分析：將原代細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每3天換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至接近融合時(shí)加入成骨性誘導(dǎo)劑(L-抗壞血酸50 mg/L、β-甘油磷酸10 mmol/L和地塞米松1×10-8mol/L)，同時(shí)按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組和磁場(chǎng)處理。成骨性分化指標(biāo)包括：①ALP：電磁場(chǎng)分別處理3、6、9、12 d后將ROBs用胰蛋白酶處理并回收，后用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，胞內(nèi)ALP活性按試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作，520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，蛋白濃度用BCA試劑盒測(cè)定。②鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量和面積：成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后棄培養(yǎng)液，PBS液漂洗2遍，加入10%多聚甲醛固定10 min。棄固定液，加入0.2%茜素紅染色液(pH 8.9)于37℃條件下孵育1 h，三蒸水漂洗3遍，清洗干凈背景即可。照相記錄圖片結(jié)果，用Image-Pro Plus 6.0軟件量化分析。③基因表達(dá)分析：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)不同磁場(chǎng)處理3 d后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS液漂洗2次。加入Trizol 750 μl裂解細(xì)胞并收集裂解液，加入氯仿200 μl混勻后室溫放置5 min，4℃ 12 000×g離心20 min。取上清，加入對(duì)半體積異丙醇，混勻后室溫放置30 min，4℃ 10 000×g離心20 min。棄上清，加入DEPC水配制的75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃ 10 000×g離心10 min。棄上清，加入無(wú)RNA酶雙蒸水30 μl重懸沉淀，-80℃保存?zhèn)溆?；逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?；PCR擴(kuò)增cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)添加PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增目的基因，RT-PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法，合成引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 各組處理3 d后行MTT分析，結(jié)果表明脈沖組和脈沖群組均可顯著刺激細(xì)胞增殖(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠成骨細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果比較

2.2對(duì)ALP活性的影響 處理3 d后，脈沖群組ALP活性高于脈沖組及對(duì)照組(P<0.05)；處理6、9 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性均高于對(duì)照組(P<0.01)；處理12 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果比較

2.3對(duì)鈣化結(jié)節(jié)的影響 茜素紅染色結(jié)果顯示，脈沖群組和脈沖組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量多于對(duì)照組，鈣化結(jié)節(jié)面積大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 3組大鼠成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果

2.4對(duì)基因表達(dá)的影響 各組處理3 d后用RT-PCR法檢測(cè)骨形成相關(guān)因子基因表達(dá)情況。脈沖群組和脈沖組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3 討論

近年來(lái)，PEMFs在骨科疾病中的應(yīng)用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其具有易操作、安全性高的特點(diǎn)[6]。研究表明，PEMFs不但可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥，而且對(duì)于緩解骨折后腫脹、骨痛、骨性關(guān)節(jié)炎等均有很好的療效[7-9]。PGEMFs是在PEMFs基礎(chǔ)上，改變了波形輸出，將原先單純的方波輸出切換為脈沖群加方波的形式輸出，為促進(jìn)骨形成、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨折愈合提供了更為廣闊的研究思路。PEMFs對(duì)ROBs增殖與礦化作用已被諸多文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，本文旨在研究PGEMFs是否有同樣的作用。

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，PEMFs和PGEMFs分別干預(yù)ROBs 3 d后，均明顯促進(jìn)了ROBs的增殖。且從圖1可以看出，脈沖群組的OD值高于脈沖組，雖然二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也能說(shuō)明PGEMFs對(duì)于ROBs增殖有明顯作用。

ALP活性是成骨性分化的早期指標(biāo)，電磁場(chǎng)干預(yù)會(huì)增加ALP活性[12]。本研究在PEMFs和PGEMFs分別干預(yù)ROBs 3、6、9、12 d后行ALP活性檢測(cè)，結(jié)果顯示干預(yù)3 d后脈沖群組ALP活性與對(duì)照組比較差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體現(xiàn)了PGEMFs促進(jìn)骨形成作用起效較早；干預(yù)6、9 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且脈沖群組ALP活性始終高于脈沖組，說(shuō)明PGEMFs作用效果強(qiáng)。而干預(yù)12 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

鈣化結(jié)節(jié)染色能夠顯示ROBs成熟礦化的情況，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量越多，說(shuō)明新骨形成的能力越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，脈沖群組和脈沖組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量多于對(duì)照組，鈣化結(jié)節(jié)面積大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明脈沖群組和脈沖組均可促進(jìn)ROBs鈣鹽的沉積，有很好的新骨形成能力。脈沖群組與脈沖組相比，前者鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量略多，鈣化結(jié)節(jié)面積略大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也可一定程度說(shuō)明PGEMFs促進(jìn)新骨形成的能力較強(qiáng)。

ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX均是骨形成調(diào)節(jié)因子，新骨形成過(guò)程離不開(kāi)這些因子的參與，可直觀反映骨形成活躍程度[13-14]。本研究圖4結(jié)果顯示，PEMFs和PGEMFs干預(yù)均可顯著增強(qiáng)ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX骨形成相關(guān)因子的基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明磁場(chǎng)干預(yù)可刺激骨形成相關(guān)因子的基因表達(dá)升高，從而起到正向調(diào)節(jié)作用，再一次證明磁場(chǎng)具有促進(jìn)骨形成的作用。脈沖群組與脈沖組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達(dá)差異雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是脈沖群組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達(dá)均高于脈沖組，說(shuō)明PGEMFs正向調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)，存在潛在優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，PGEMFs可通過(guò)促進(jìn)ROBs細(xì)胞增殖、提高ALP活性、增加鈣鹽沉積量及調(diào)節(jié)骨形成相關(guān)因子的基因表達(dá)，從而增加ROBs的成熟礦化，具有很強(qiáng)的促進(jìn)骨形成能力。然而，PGEMFs是否也會(huì)增加大鼠峰值骨量、抑制或治療去勢(shì)大鼠的骨丟失及加速骨折愈合等作用尚有待課題組進(jìn)一步研究。