川陳皮素經(jīng)AKT/GSK 3β/NF-κB通路抑制Kupffer細(xì)胞活化減輕大鼠原位肝移植后缺血再灌注損傷①

王敬元 李生偉 吳涯昆（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010）

肝移植可作為各種晚期肝病的治療方法，但肝移植誘導(dǎo)的肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfu?sion injury，IRI）可影響移植肝的功能，并加重免疫排斥反應(yīng)［1］。既往研究表明，IRI由活性氧釋放、巨噬細(xì)胞活化、黏附分子以及細(xì)胞凋亡等多種因素共同參與［2-4］。庫普弗細(xì)胞（kuppffer cells，KCs）是肝臟中的常駐巨噬細(xì)胞，參與肝臟多種免疫反應(yīng)，可通過改變自身活化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)肝臟炎癥水平，其中M1型KCs可誘導(dǎo)促炎因子的分泌，促進(jìn)肝臟的炎癥水平，加重IRI程度，因此，通過抑制KCs的M1型極化和后續(xù)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)可以有效減輕IRI程度［5-7］。

川陳皮素是一種主要存在于柑桔果皮中的聚甲氧基黃酮，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化及抗糖尿病等調(diào)節(jié)免疫功能的生物學(xué)特性［8-10］。川陳皮素還可通過抑制活性氧的產(chǎn)生來減輕腦和心肌IRI，但其在肝臟IRI中的作用研究還尚有欠缺［11-12］。因此，我們使用川陳皮素預(yù)處理大鼠，以研究該藥在大鼠肝移植后肝臟IRI模型中的作用及其機(jī)制，為肝移植后肝臟IRI的藥物治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6～8周齡，200～250 g）購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級喂養(yǎng)，自由飲食，光照/黑暗每12 h進(jìn)行交替。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵守重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會發(fā)布的倫理及管理指南。

1.1.2 試劑及儀器 川陳皮素購自西安小草植物科技有限公司；COX2、AKT、p-AKT均購自美國Cell Signaling Technology公司；MCP-1、iNOS、GSK3β、p-GSK3β、NF-κB P65、p-P65、Cleaved-caspase3、Cas?pase3、Bcl-2、Bax均購自美國Abcam公司；ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；PCR試劑盒購自TaKaRa；TUNEL試劑盒購自博士德公司；HE染色試劑盒購自碧云天公司；氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（clodronate liposomes，CL）購自美國Encapsula Nano?Sciences；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自MCE公司；全自動生化儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 肝移植模型構(gòu)建 肝移植供體及受體均為SD大鼠，根據(jù)Kamada肝移植操作方法［13］稍做改動，麻醉方法采用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射（60 mg/kg）。川陳皮素處理組中，采用DMSO充分溶解川陳皮素后，使用生理鹽水稀釋至6 mg/ml，供體大鼠每天經(jīng)尾靜脈注射川陳皮素（50 mg/kg）一次，持續(xù)1周［14］。LT+CL+川陳皮素組中，術(shù)前48 h對供受體尾靜脈注射CL（4μl/g）阻斷KCs功能，其余處理同前［15］。移植肝冷缺血時間為60 min，再灌注3 h、6 h、12 h、24 h后獲取血清及組織標(biāo)本進(jìn)行ELISA、自動生化儀檢測、Western blot、HE等實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.2 提取KCs 根據(jù)LI等［16］所提到的方法，經(jīng)門靜脈灌注含0.05%Ⅳ型膠原酶的PBS至肝臟變黃變軟。使用差速離心法將非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞分開，采用Percoll溶液將KCs從非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中分離出來，將提取的KCs置于37℃，5%CO2，濕度為95%的培養(yǎng)箱中，10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM中培養(yǎng)。采用CD68進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，其中CD68陽性者為KCs。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，川陳皮素組使用不同濃度（0、5、10、20、40μmol/L）川陳皮素處理24 h，再使用LPS（Sigma；100 ng/ml）處理3 h，收集各組細(xì)胞及上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.3 Western blot 根據(jù)蛋白提取試劑盒說明將PMSF與RIPA按1：100的比例配制，使PMSF終濃度為1 mmol/L，將其加入各組細(xì)胞或肝組織中進(jìn)行裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白分子量不同，將蛋白加入10%或12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)印于PVDF膜（Millipore）上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，將PVDF膜與一抗4℃孵育過夜，將膜洗滌后與辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG抗體于37℃孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進(jìn)行檢測，采用ImageJ軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 ELISA 使用ELISA試劑盒檢測KCs上清液以及血清中的炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10，并按提供的公式計(jì)算各因子濃度。將對應(yīng)一抗按100μl/孔加入白板置于37℃下孵育4 h，棄去板中液體，加入封閉液于37℃封閉1 h，棄去封閉液，洗滌液洗滌5 min×3遍，拍干孔中殘余液體，按100μl/孔加入血清或細(xì)胞上清液，37℃下孵育1 h，洗滌5 min×3遍，加入酶標(biāo)抗體于37℃下孵育1 h，洗滌5 min×3遍，加入底物，37℃下避光反應(yīng)5 min，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 TUNEL細(xì)胞凋亡染色 TUNEL染色依據(jù)說明書（博士德）進(jìn)行操作，取出石蠟切片脫蠟并按無水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇，水的順序進(jìn)行水化，配制Proteinase K，滴于樣片室溫消化15 min，TBS洗滌2 min×3次，加標(biāo)記緩沖液保持樣片濕潤，用1μl TdT+1μl DIG-d-UTP+18μl標(biāo)記緩沖液室溫標(biāo)記2 h，再次洗滌后用山羊血清室溫封閉30 min，與生物素化抗地高辛抗體室溫孵育30 min，洗滌后與SABC-FITC孵育30 min，使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色10 min，滴加封片劑后采用熒光顯微鏡（Olympus）觀察采圖。

1.2.6 HE染色 將肝組織浸入10%多聚甲醛中固定，制成石蠟包塊后切片，根據(jù)碧云天HE染色試劑盒說明進(jìn)行操作，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察采圖，使用SUZUKI法［17］對各組進(jìn)行評分。

1.2.7 肝功測定 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）采用全自動生化儀（Beckman CX7）進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)P＜0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川陳皮素抑制LPS活化的KCs中炎癥因子的表達(dá) 根據(jù)LI等［16］的方法提取正常SD大鼠KCs，培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，使用CCK-8法檢測不同濃度（5、10、20、40μmol/L）川陳皮素對KCs活力的影響，結(jié)果顯示40μmol/L組有明顯降低（P＜0.05），而其余3組無明顯差異（圖1A），表明40μmol/L濃度的川陳皮素抑制KCs的活力，因此選擇5、10、20μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究表明，KCs的活化及炎癥因子的釋放在肝臟IRI中起著重要作用，因此，檢測了LPS活化的KCs中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白水平，結(jié)果顯示，LPS（100 ng/ml）處理后，與未用LPS處理組相比，其IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白表達(dá)水平都明顯升高，而川陳皮素處理能夠抑制其炎癥因子的表達(dá)，并具有一定的劑量依賴性（P＜0.05，圖1B、C）。ELISA檢測了各組細(xì)胞上清中炎癥因子的水平，結(jié)果表明川陳皮素能夠抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，促進(jìn)抑炎因子IL-10的分泌（P＜0.05，圖1D）。以上結(jié)果表明川陳皮素能夠抑制KCs中炎癥因子的分泌。

圖1 川陳皮素對KCs炎癥因子的影響Fig.1 Effectsof nobiletin on inflammatory cytokinesin KCs

圖2各濃度川陳皮素對KCs中AKT/GSK 3β/NF-κB信號通路的影響Fig.2 Effects of nobiletin at different concentrations on AKT/GSK3β/NF-κB pathway in KCs

2.2 川陳皮素通過AKT/GSK3β/NF-κB信號通路抑制KCs活化 AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與巨噬細(xì)胞的活化以及多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展［18］。NF-κB的過度激活及其下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)在肝臟IR損傷過程中發(fā)揮重要作用［19］。為驗(yàn)證川陳皮素影響KCs的活化及功能的機(jī)制，采用Western blot檢測了AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、NF-κBP65和p-P65的水平，結(jié)果顯示，AKT/GSK3β/NF-κB通路的磷酸化水平在LPS處理組明顯高于對照組，而川陳皮素能夠有效降低p-GSK3β和p-P65的表達(dá)水平，這與p-AKT的表達(dá)一致（P＜0.05，圖2A、B）。以上結(jié)果表明川陳皮素可能通過抑制AKT/GSK3β/NF-κB通路來抑制KCs的活化及功能。

2.3 川陳皮素預(yù)處理減輕肝移植后IRI 我們通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平及觀察HE染色結(jié)果評估川陳皮素預(yù)處理對大鼠肝移植后肝臟IRI程度的影響。結(jié)果顯示術(shù)后各時間點(diǎn)血清ALT、AST水平均高于假手術(shù)組，提示肝移植術(shù)后肝臟明顯受損，然而，各時間點(diǎn)LT+川陳皮素組血清ALT、AST的水平較LT組都明顯降低，這提示川陳皮素可有效減輕肝移植術(shù)后肝臟IRI（P＜0.05，圖3A）。肝組織（再灌注24 h）HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)川陳皮素對IRI肝臟的保護(hù)作用，HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組的肝小葉形態(tài)基本正常，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，LT組可見肝小葉周邊細(xì)胞腫脹明顯，胞漿空泡化，并有大量淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞浸潤，與之相比，LT+川陳皮素組腫脹細(xì)胞明顯減少，且胞質(zhì)空泡化和炎癥細(xì)胞浸潤程度也明顯減輕（P＜0.05，圖3B）。

2.4 川陳皮素預(yù)處理減輕IRI肝臟的凋亡水平肝移植后，IRI可誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，我們使用TUNEL實(shí)驗(yàn)來檢測川陳皮素對肝移植肝臟IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明LT組的肝組織顯示TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量高于假手術(shù)組，此外，LT+川陳皮素組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于LT組（P＜0.05），在使用CL阻斷肝臟KCs后，移植肝中TU?NEL陽性細(xì)胞數(shù)較川陳皮素處理組明顯增加（P＜0.05），而與LT組無顯著差別（圖4A）。以上結(jié)果提示川陳皮素可有效抑制肝移植后肝臟中的凋亡水平，并且在一定程度上依賴KCs發(fā)揮作用。我們從蛋白水平也證實(shí)川陳皮素能夠有效降低缺血再灌注肝臟的凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Bax的水平，并抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)（P＜0.05，圖4B）。以上結(jié)果表明，川陳皮素能夠通過抑制肝臟細(xì)胞凋亡有效減輕肝移植后肝臟IRI引起的肝損傷。

圖3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中川陳皮素對缺血再灌注肝臟的影響Fig.3 Effects of nobiletin on ischemia-reperfusion liver in vivo

2.5 川陳皮素抑制KCs的M1型極化并減輕肝移植后肝臟IRI引起的肝臟炎癥反應(yīng) KCs是肝臟中的常駐巨噬細(xì)胞，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡中起重要作用。其中M1型KCs在促進(jìn)肝臟炎癥發(fā)生中起重要作用，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測了M1型極化（CD68和CD86雙陽性）KCs的比例，結(jié)果顯示，川陳皮素明顯抑制CD68+CD86+KCs的比例（P＜0.05，圖5A）。表明川陳皮素能夠明顯抑制肝移植后肝臟中KCs的M1型極化。采用ELISA法進(jìn)一步檢測血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，結(jié)果顯示與LT組相比，LT+川陳皮素組中炎癥因子顯著降低（P＜0.05），這表明川陳皮素可抑制肝移植后肝臟IRI引起的炎癥反應(yīng)（圖5B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其機(jī)制，我們還檢測了各組KCs中AKT/GSK3β/NF-κB信號通路的活性，結(jié)果提示與LT組相比，LT+川陳皮素組p-AKT、p-GSK3β、p-P65的蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖5C）。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AKT/GSK3β/NF-κB信號通路可能參與川陳皮素對肝移植后肝臟IRI的調(diào)節(jié)作用。

圖4 川陳皮素對缺血再灌注肝臟凋亡水平的影響Fig.4 Effects of nobiletin on the cell apoptosis in liver af?ter ischemia-reperfusion

圖5 川陳皮素對缺血再灌注肝臟KCs活化及炎癥水平的影響Fig.5 Effects of nobiletin on KCs activation and inflam?mation in ischemia-reperfusion liver

3 結(jié)論

肝臟腫瘤切除、低血容量性休克和肝移植過程都可引起肝臟IRI，尤其是在肝移植手術(shù)中，IR可引起肝功受損，進(jìn)而加重肝移植后急慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生［20］。由于IRI缺少有效的治療方法，因此對相關(guān)藥物的研究很有必要。以往研究表明，肝臟IRI由多種因素引起，包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的激活、氧化應(yīng)激以及先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的促炎因子［21-22］，其中巨噬細(xì)胞的活化及其下游炎癥反應(yīng)在IRI過程中起著至關(guān)重要的作用［23］，因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化程度及其下游炎癥通路有助于減輕肝臟IRI。

川陳皮素作為柑橘類水果的主要成分，在抗糖尿病、抗癌、抗氧化應(yīng)激及炎癥疾病中都有研究［8-10］。川陳皮素能夠有效減輕腦及腎臟IRI，但在肝臟IRI中的作用研究尚有欠缺［11-12］。KCs是肝臟巨噬細(xì)胞的主要部分，具有吞噬、抗原呈遞及釋放炎癥因子等免疫調(diào)節(jié)功能，在肝臟IRI中發(fā)揮重要作用［24-25］。肝移植后可引起KCs活化，進(jìn)而啟動黏附分子的表達(dá)并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的激活，此外，KCs還可釋放活性氧及炎癥介質(zhì)進(jìn)一步加重肝損傷［26-27］?？紤]到川陳皮素對其他缺血器官的保護(hù)作用，結(jié)合川陳皮素的抗炎特性，對川陳皮素在調(diào)節(jié)肝臟KCs活化、炎癥水平以及對大鼠肝移植誘導(dǎo)的冷缺血再灌注損傷方面進(jìn)行了研究。

本研究在體外使用LPS處理活化KCs，Western blot檢測到炎癥相關(guān)因子如IL-1β、TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)增加，ELISA檢測到細(xì)胞上清液中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的水平升高。然而，在川陳皮素處理組中，促炎因子的水平明顯降低，這表明川陳皮素抑制了KCs的活化和分泌促炎因子的功能。同時我們檢測到AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與巨噬細(xì)胞的活化以及IRI過程，川陳皮素可抑制AKT/GSK3β/NF-κB信號通路中p-AKT、p-GSK3β、p-P65的表達(dá)，表明川陳皮素可能經(jīng)該通路發(fā)揮對缺血再灌注肝臟的保護(hù)作用，但川陳皮素還可能通過其他途徑如JAK/STAT通路發(fā)揮作用，這有待進(jìn)一步研究來證實(shí)。本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的水平，表明川陳皮素預(yù)處理可以緩解IR誘導(dǎo)的肝功能損傷程度，且HE染色結(jié)果證明其能夠有效減輕IRI，同時川陳皮素能夠降低血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，證明其具有明顯的抗炎作用。TUNEL實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)川陳皮素能夠降低缺血再灌注肝臟內(nèi)細(xì)胞的凋亡水平。

以上數(shù)據(jù)共同表明川陳皮素能夠有效抑制KCs活化及其炎癥因子的分泌，減輕肝移植后肝臟IRI，且AKT/GSK3β/NF-κB信號通路參與了該保護(hù)作用，但尚有其他可能機(jī)制參與其中，需要進(jìn)一步研究。