柿葉黃酮納米脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化*

霍元子，屈懷東，王連艷，徐世一，閻雪瑩

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100089）

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿的新鮮或干燥葉[1]。由于柿葉中所含的黃酮類化合物（PLF）有明顯的藥理活性、確切的臨床療效，其在抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化、抗惡性腫瘤、抗心腦血管疾病等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前，以PLF為主要有效成分的中成藥（腦心清片）已應(yīng)用于臨床[2,3]。由于其脂溶性較低，而脂質(zhì)體作為給藥載體能夠有效地解決水溶性藥物的脂溶性問題，提高藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力?？ú吩谳^寬pH值范圍內(nèi)可以保持相對穩(wěn)定且具有一定的生物粘附性，能夠相對地延長藥物在吸收位點(diǎn)的作用時(shí)間，從而改進(jìn)口服藥物的療效[4]。本論文采用UV-Vis對柿葉中總黃酮進(jìn)行測定，為研究制備新型柿葉黃酮脂質(zhì)體（PLF-Lip）制劑提供理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探索應(yīng)用于臨床的新型納米給藥系統(tǒng)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

UV9100CPC型紫外-可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；JEOL-2010型透射電子顯微鏡（日本島津公司）；Nano-ZS90型激光粒度-電位分析儀（馬爾文儀器有限公司）；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MD-200-2型氮?dú)獯蹈蓛x（天津恒奧科技有限公司）。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院 批號：100080-201610）；PLF提取物（西安開來生物工程有限公司，純度≥80%）；大豆卵磷脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），膽固醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），卡波姆（北京迪馬科技有限公司），殼聚糖（北京迪馬科技有限公司），聚維酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），HAc等其他試劑為分析純。

1.2 方法

UV-Vis是測定PLF最為簡便高效的方法。由于本研究所采用的PLF（黃酮含量≥80%）還含有其他成分，為便于PLF的定量分析，選擇蘆丁作為指標(biāo)性成分，測得的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)實(shí)際是蘆丁的理化性質(zhì)指標(biāo)。

1.2.1 PLF-Lip的制備 精密稱取處方量的脂質(zhì)材料和PLF，置于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40℃、50r·min-1旋轉(zhuǎn)除去無水乙醇至無醇味，通入2h N2，靜置過夜，除盡有機(jī)物。加入適量去離子水和若干玻璃珠，水化2h，水化液依次經(jīng)過0.45、0.22μm有機(jī)濾膜濾過即得。

1.2.2 處方設(shè)計(jì)與篩選 以PLF-Lip的EE%和DL%為評價(jià)指標(biāo),通過單因素考察藥脂比、PC∶Ch的值（卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比）、磷脂濃度（CPC）、水化介質(zhì)的種類、水化介質(zhì)的pH值5個(gè)因素對PLF-Lip EE%和DL%的影響,針對關(guān)鍵因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化[5]。

1.2.3 UV-Vis檢測方法的建立

1.2.3.1 檢測波長的確定 取對照品溶液和供試品溶液適量，以不含蘆丁、PLF的溶液作空白溶劑，在200～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄最大吸收波長。如圖1，對照品溶液、供試品溶液均在362nm位置有最大的吸收峰，參照2015版《中國藥典》，最終檢測波長確定為362nm[6]。

圖1 蘆丁對照品、PLF供試品的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of rutin standard and persimmon leaf flavonoid sample

1.2.3.2 線性關(guān)系考察 取對照品溶液用95%乙醇稀釋，配成濃度（C）為25.000、20.000、12.500、6.250、3.125μg·mL-1的5組蘆丁對照品溶液，于362nm波長處測定吸光度（A）。并以C為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程：A=0.0281C+0.0150（R2=0.9992）。表明蘆丁對照品在3.125～25.000μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法學(xué)考察中結(jié)果均符合2015年版《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定。

1.2.3.3 含量測定 精密量取適量的供試品溶液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，利用UV-Vis在362nm處檢測A，利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。結(jié)果表明，以蘆丁計(jì)PLF提取物中總黃酮含量約為84.32%。

1.2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按得出的最佳工藝處方平行制備3批PLF-Lip，測算的EE%分別為83.5%、85.2%、86.1%，RSD%結(jié)果為1.55%，說明優(yōu)化的處方工藝可靠。

1.2.4 包衣PLF-Lip的制備

1.2.4.1 制備 在預(yù)試驗(yàn)中對包衣材料進(jìn)行了篩選，選定卡波姆作為本次試驗(yàn)的包衣材料，將新鮮制備的PLF-Lip與等體積一定濃度的卡波姆溶液混合，45r·min-1磁力攪拌30min，再孵育30min。4℃冰箱中靜置過夜，即得卡波姆包衣的PLF-Lip。

1.2.4.2 卡波姆濃度對相對包衣率（CR%）的影響配制0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0g·L-1的卡波姆包衣液，制備6組不同濃度卡波姆包衣的PLF-Lip。稀釋適當(dāng)倍數(shù)于510nm處檢測卡波姆包衣的PLF-Lip的吸光度（A），按照下式計(jì)算CR%。以10.0g·L-1卡波姆的包衣率計(jì)為100%，其他濃度的CR%見表4。

式中AL：PLF-Lip的吸光度；A10：10g·L-1卡波姆包衣脂質(zhì)體的吸光度；AL和A10：固定值。

2 結(jié)果和討論

2.1 單因素考察

通過單因素考察藥脂比、PC∶Ch的值、水化介質(zhì)的pH值、CPC和介質(zhì)種類這5個(gè)因素，以EE%和DL%為評價(jià)指標(biāo)，確定主要影響因素，再通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以EE%為單一評價(jià)指標(biāo)，確定最終的最佳優(yōu)化處方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

確定藥脂比為1∶20、PC∶Ch為10∶1、CPC=10mg·mL-1、水化介質(zhì)的pH值為7.0，由于介質(zhì)種類對兩種指標(biāo)的影響較小，且考慮到制劑成本，最終選擇去離子水作為水化介質(zhì)。

圖2 單因素考察結(jié)果圖Fig.2 Single factor investigation result chart

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方

2.2.1 因素與水平 通過單因素考察初步確定藥脂比（A）、PC∶Ch的值（B）、水化介質(zhì)的pH值（C）和CPC（D）這4個(gè)主要影響因素，為進(jìn)一步整體分析這些因素對EE%的影響，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝。且每組因素設(shè)置3個(gè)水平，見表1。

表1 因素-水平表Tab.1 Table of factor-level

2.2.2 結(jié)果分析 按正交表中的9組處方完成實(shí)驗(yàn)操作，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

各種因素對EE%的影響由大到小的順序均為：B＞D＞A＞C，在實(shí)驗(yàn)所選的因素中，水化介質(zhì)的pH值對EE%的影響作用最小，藥脂比對EE%的影響作用最大。因此依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，并兼顧藥物穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性原則，優(yōu)化制備處方為B2D3A2C2。確定藥脂比為1∶20、PC∶Ch=10∶1、CPC=15mg·mL-1，水化介質(zhì)為pH值為7的去離子水。

表2 正交設(shè)計(jì)表及包封率結(jié)果（n=3）Tab.2 Orthogonal design table and encapsulation results（n=3）

表3 包封率的方差分析表Tab.3 Variance analysis table for encapsulation rate

2.3 包衣材料濃度的選擇

表4 卡波姆濃度對CR%的影響（n=3）Tab.4 Effect of carbomer concentration on CR%（n=3）

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著卡波姆濃度的增加，PLFLip的CR%升高。說明在PLF-Lip的外層包上了卡波姆衣層。穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，在保證不改變物理穩(wěn)定性、EE%的前提下，確定以5g·L-1的卡波姆溶液作為最終的包衣材料。

2.4 表征

2.4.1 外觀及TEM觀察結(jié)果（圖3）按最佳工藝制備的卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，用肉眼觀察為白色乳狀混懸液，均勻且未見不溶性顆粒物。將樣品置于TEM下觀察呈橢球型囊泡結(jié)構(gòu)，外形圓整，粒徑大小與粒度分析儀測出結(jié)果吻合。

圖3 Oral-PLF-Lip的外觀（a）和TEM觀察結(jié)果（b）Fig.3 Appearance of Oral-PLF-Lip（a）and TEM observation results（b）

2.4.2 粒徑和電位（圖4） 采用納米粒徑及Zeta電位分析儀對卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip的粒徑和Zeta電位進(jìn)行分析。平均粒徑為（257.2±9.3）nm，帶有負(fù)電性，電位為（-47.1±2.2）mV，分布均勻，有良好的穩(wěn)定性。

圖4 Oral-PLF-Lip的粒徑（a）和Zeta電位（b）分布圖Fig.4 Distribution diagram of particle size（a）and Zeta potential（b）of Oral-PLF-Lip

圖4 （a）的橫軸取值范圍縮小點(diǎn)；（b）的橫軸從-100～100范圍內(nèi)作圖。

3 結(jié)論

本研究以PLF為模型藥物，優(yōu)化了PLF-Lip的制備工藝，采用TFD-孵育法成功制備了卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，主藥用量為10mg，藥脂比1∶20，卵磷脂∶膽固醇（PC∶Ch）=10∶1，磷脂濃度（CPC）為15mg·mL-1，包衣材料濃度5g·L-1，透射電鏡下該脂質(zhì)體呈現(xiàn)橢球形囊泡結(jié)構(gòu)，外觀均勻圓整。平均Zeta電位為（-47.1±2.2）mV，平均粒徑為（257.2±9.3）nm。該處方工藝適用于口服包衣柿葉黃酮納米脂質(zhì)體的制備。為PLF能夠更好地跨膜吸收從而提高生物利用度、提高療效奠定了一定基礎(chǔ)。