大麥對大麥條紋病菌毒素脅迫的響應(yīng)

孫莉莎，郭 銘，司二靜，姚立蓉，汪軍成， 李葆春，楊 軻，孟亞雄，馬小樂，王化俊

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

大麥(HordeumvulgareL.)屬于禾本科一年生植物，是最早被馴化的作物之一。由于其具有早熟、耐鹽、耐旱和耐貧瘠等特性，在世界各地均有種植，在中國已種植了數(shù)千年[1]。在世界耕作谷物中，大麥的種植總面積和產(chǎn)量位居第四，僅次于小麥、水稻和玉米；中國的大麥現(xiàn)多種植于淮河流域及其以北地區(qū)[2]。

大麥條紋病(barley leaf stripe )是由大麥條紋病菌Pyrenophoragraminea(anamorph Drechslea graminea)[(Rabenh.ex.Schlech.)Shoemaker]引起的以種子帶菌為初侵染源的系統(tǒng)性病害[3]。大多數(shù)大麥種植都是自留種，受病菌侵染嚴(yán)重，雖然新品種在推廣種植初期發(fā)病較輕，但隨著種植年限增加，發(fā)病會逐漸嚴(yán)重[4]。大麥條紋病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，甘肅省是在中國發(fā)病的主要地區(qū)之一[5]。Arabi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大麥條紋病菌毒性受1對顯性基因控制。大麥條紋病菌屬于植物病原真菌，其產(chǎn)生的毒素原初作用位點可能在寄主的細胞質(zhì)膜上[7]，這些毒素先破壞細胞質(zhì)膜系統(tǒng)，使電解質(zhì)滲漏增加，從而達到對寄主的破壞作用。影響病原菌致病力的因素主要有致病因子類型及其活性，酶、毒素、激素是病原菌的三大致病因子，病原菌產(chǎn)生的毒素或病原菌與寄主協(xié)同作用產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以引起植物萎蔫并表現(xiàn)出組織壞死等癥狀[8]。研究發(fā)現(xiàn)，用病原菌毒素處理材料,可以快速篩選出抗病材料[9]，這對植物的抗性鑒定及抗病育種有重要的意義。馬瑩瑩等[10]研究表明，玉米在接種玉蜀黍尾孢菌毒素后，其葉片中防御酶活性升高，且在7 h時達到峰值，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量降低。吳穎靜等[11]研究表明，擬南芥被大麗輪枝菌侵染后，其胼胝質(zhì)、活性氧含量和防御酶活性均升高。但關(guān)于大麥條紋病菌毒素與大麥生長及其防御酶活性關(guān)系的研究尚未見報道。鑒于此，本研究擬以20個大麥品種為供試材料，研究大麥條紋病菌毒素對大麥萌發(fā)、胚根和胚芽生長的影響，并對篩選出的強抗病性品種進行毒素脅迫下防御酶活性變化的研究，確定毒素脅迫處理的最適時間，篩選衡量大麥條紋病菌抗性水平的防御酶指標(biāo)，以便在室內(nèi)完成對大麥抗性品種的初步篩選及鑒定，為大麥條紋病菌抗性機制的研究和抗性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大麥條紋病菌菌株QWC為強致病力型菌株[12]。供試大麥材料詳見表1，均由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室麥類種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。

表1 供試大麥品種及品系Table 1 Barley varieties(lines) tested

1.2 方法

1.2.1 改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備

9 g蔗糖、5 g酒石酸銨、1 g NH4NO3、1 g K2HPO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.1 g NaCl、 0.13 g CaCl2·2H2O、18.3 mg FeSO4·7H2O、3.5 mg ZnSO4·7H2O、2 mg MnCl2·4H2O，蒸餾水定容至1 L。

1.2.2 大麥條紋病菌毒素液的制備

將低溫保存的QWC菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，22 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，沿菌餅邊緣打直徑10 mm的菌餅，置于200 mL改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d；培養(yǎng)液經(jīng)無菌濾紙過濾后得到含QWC菌株代謝物的濾液。

1.2.3 菌株QWC的毒性測定

用葉脈注射器將4 mL 1.2.2中得到的濾液注入大麥幼苗植株中并做好標(biāo)記，置于人工氣候室中光(20 ℃)暗(12 ℃)各12 h交替培養(yǎng)，7 d后在標(biāo)記處出現(xiàn)帶狀條紋說明所得濾液含有毒素，為毒素液。

1.2.4 供試材料抗性測定

用70%的乙醇處理大麥種子(每個材料對照和處理各30粒種子)30 s后，用5%的次氯酸鈉處理5 min，經(jīng)無菌水沖洗4次后徹底晾干(約3 h)；將種子置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿上，濾紙事先用毒素液或無菌水(對照)潤濕，蓋好蓋子置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h、48 h、72 h后調(diào)查大麥種子萌發(fā)數(shù)；120 h后測種子萌發(fā)抑制率及胚根和胚芽生長抑制率[13]。3次重復(fù)。

萌發(fā)抑制率=(對照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù))/對照萌發(fā)數(shù)×100%

胚根/胚芽生長抑制率=(對照胚根/胚芽長-處理胚根/胚芽長)/(對照胚根/胚芽長)×100%

1.2.5 大麥防御酶活性及代謝物相關(guān)指標(biāo)測定

選擇高抗大麥材料按照1.2.4中方法將種子培養(yǎng)48 h、 72 h、120 h、168 h后，每個處理分別采樣5 g，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定；過氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑還原法測定；過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮法測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，運用Duncan’s檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥條紋病菌培養(yǎng)液毒性測定

將含QWC代謝物的濾液注入大麥葉片7 d后發(fā)現(xiàn)，從葉片基部到葉尖出現(xiàn)多條與葉脈相平行的細長條紋，顏色呈黃褐色(圖1)。這些癥狀與條紋病的發(fā)病癥狀相一致。因此，可以認為所得濾液對大麥有致病作用，為毒素液。

2.2 大麥條紋病菌毒素液對大麥種子生長的 影響

2.2.1 對大麥種子萌發(fā)的影響

萌發(fā)24 h和48 h時，毒素液處理大麥材料的外觀與各自的對照無明顯差異；萌發(fā)72 h和120 h時，毒素液處理材料胚根和胚芽的長勢均明顯較各自對照弱，說明大麥條紋病菌毒素對大麥萌發(fā)有一定抑制作用。部分材料處理與相應(yīng)對照見圖2。

2.2.2 供試大麥材料萌發(fā)及生長指標(biāo)分析

根據(jù)種子萌發(fā)抑制率對20個材料進行聚類分析，結(jié)果如圖3，當(dāng)歐氏距離為15時，20個大麥材料被分為3類，Ⅰ型(1，5%)、Ⅱ型(12，60%)和Ⅲ型(7，35%)。對3個類型材料間的萌發(fā)和生長指標(biāo)進行分析，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，毒素下3個類型材料間的萌發(fā)抑制率、胚芽生長抑制率和胚根生長抑制率的差異均達顯著水平， Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分別為高抗型、中抗型和高感型。其中，高抗型僅包含一種材料，為甘啤2號。

表2 毒素對不同類型大麥材料種子萌發(fā)及生長的影響Table 2 Effect of toxins on seed germination and growth of different types barley cultivars %

20個大麥材料在毒素液培養(yǎng)下的萌發(fā)抑制率、胚芽生長抑制率和胚根生長抑制率的平均值分別是10.43%、56.03%和77.69%，說明較胚芽而言，毒素液對胚根的抑制作用更強。

毒素對甘啤2號的萌發(fā)抑制率及胚芽、胚根生長抑制率相對于其他材料均為最低，因此，對甘啤2號在毒素脅迫下其體內(nèi)防御酶活性及游離脯氨酸、丙二醛含量的變化進行進一步研究。

2.3 大麥條紋病菌毒素對甘啤2號生理指標(biāo)的影響

2.3.1 對相關(guān)防御酶活性的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長，大麥中POD活性整體呈上升的趨勢，毒素液培養(yǎng)48、72、120、168 h的甘啤2號中POD活性分別較對照增加了 6.72%、14.99%、25.50%、27.03%，其中，在 120 h和168 h時，處理間差異達到顯著水平 (P<0.05)(圖4A)。麥芽中SOD活性總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在72 h時達到最低；4個時間點處理間差異均達到顯著水平(P<0.05)；在120 h時，毒素液培養(yǎng)較對照的增幅最大，為 95.48%(圖4B)。麥芽中CAT活性也隨培養(yǎng)時間推移呈先降低后升高的趨勢，在72 h時達到最低，處理間差異不顯著，且顯著低于其他時間點；在48 h、120 h和168 h時，毒素液培養(yǎng)與對照間差異均達顯著水平(P<0.05)；在168 h時，毒素液培養(yǎng)較對照的增幅最大，為49.63%(圖4C)。

2.3.2 對游離脯氨酸(Pro)及丙二醛(MDA)含量的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長，甘啤2號的Pro含量整體呈上升趨勢，且在各個時間點毒素液培養(yǎng)與無菌水培養(yǎng)間差異均顯著(P<0.05)；培養(yǎng)72 h后，Pro含量急劇增高，而在120 h之后增幅趨于平緩(圖5A)。MDA含量隨培養(yǎng)時間推移整體呈先上升后下降趨勢，且在各個時間點，處理間均存在顯著差異(P<0.05)，以72 h時差異最大(圖5B)。

3 討 論

大量研究表明，大部分植物病原真菌可產(chǎn)生毒素，這些毒素會對植物種子萌發(fā)及生長產(chǎn)生抑制作用，如黑穗病病原菌可以破壞寄主的組織結(jié)構(gòu)，造成寄主組織壞死、胼胝質(zhì)沉積、電解質(zhì)滲漏，影響糜子植株的正常生長[15]。田雪亮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜枯萎菌毒素對不同抗性品種的黃瓜胚根生長均有抑制作用，并且抑制作用會隨處理濃度的增加而增強，但對抗病品種的抑制作用低于感病品種；楊繼芝[17]認為，小麥胚根對禾谷鐮刀菌毒素的敏感性大于胚芽。本研究與前人研究結(jié)果基本一致，大麥紋枯病菌毒素可抑制大麥種子的萌發(fā)和胚根、胚芽的生長。通過對供試材料的萌發(fā)抑制率進行聚類分析，可將20個大麥品種分為3類，高抗型占5%，中抗型占60%，高感型占35%；大麥紋枯病菌毒素對不同抗性類型間大麥種子的萌發(fā)抑制率和胚根、胚芽生長抑制率均存在顯著差異。但車建美等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜枯萎病菌粗毒素液對培養(yǎng)5～10 d的黃瓜種子的萌發(fā)具有明顯的促進作用，對胚根也有促生長作用，并且粗毒素液處理黃瓜幼苗明顯高于對照組。這與本研究結(jié)果不一致，其原因可能與病原菌及作物不同有關(guān)。

POD、SOD、CAT是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶，植物體內(nèi)自由基清除或抗氧化能力的強弱可以由防御酶的活性高低直接反映，因此防御酶活性可作為植物抗逆性的指標(biāo)[18]。植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生大量Pro等有機物，以應(yīng)對不良環(huán)境條件對植物生理代謝系統(tǒng)造成的損傷[19]。MDA的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[20]。關(guān)于植物病原菌與植物防御酶活性的關(guān)系有很多報道，孫潤紅等[21]發(fā)現(xiàn)，感染枯草芽孢桿菌的小麥中POD、SOD以及CAT等防御酶活性有不同程度的提高。黃志磊[22]發(fā)現(xiàn)，受大麥葉斑病浸染的大麥中SOD、POD、CTA活性及Pro含量在各個時期均有所提高。楊繼芝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌粗毒素可使小麥抗病品種葉片中CAT活性增強，MDA含量下降。本研究中，受大麥條紋病菌毒素浸染后，甘啤2號的SOD、POD、CAT活性和Pro、MDA含量在處理間存在明顯差異，在種子培養(yǎng)120 h和168 h時，被測指標(biāo)在處理間均有顯著差異。在培養(yǎng)72 h時，甘啤2號的SOD、CAT活性均達到最小值，而MDA含量達最大值，說明甘啤2號在種子萌發(fā)第72 h時防御酶活性及Pro、MDA含量變化較大。

本研究從生理方面研究了接種大麥條紋病菌毒素后，大麥幼苗生長及防御酶活性變化的關(guān)系。結(jié)果是否與大田生產(chǎn)一致還有待更多和長時間、多品種試驗。大麥條紋病菌毒素對大麥防御酶活性的影響的分子機制還有待進一步研究。