不同殺菌劑對(duì)小麥真菌毒素污染防控及農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析

吳 麗，孫 娟,2，張慧杰，胡學(xué)旭，李為喜，孫麗娟，張 妍，杜文明，王步軍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100081; 2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100170)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，簡(jiǎn)稱FHB或Scab)是由鐮孢菌屬(Fusariumspecies)病菌引起的一種典型的氣候型、世界性病害，以溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)較重，是危害小麥生產(chǎn)的主要病害之一。赤霉病菌侵染小麥后，不僅會(huì)嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與品質(zhì)，其產(chǎn)生的多種真菌毒素進(jìn)入食物鏈還可嚴(yán)重危害牲畜與人類健康。我國(guó)小麥赤霉病主要發(fā)生于濕潤(rùn)多雨的長(zhǎng)江流域和沿海麥區(qū)。小麥在不同生育期都可能感染赤霉病，抽穗揚(yáng)花期是最易感病期，若此時(shí)遇陰雨天氣，極易造成赤霉病大流行,可造成小麥減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)80%～90%[1]。赤霉菌產(chǎn)生的常見真菌毒素包括單端孢霉烯族化合物(trichothecenes)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、伏馬毒素(fumonisins，F(xiàn)B)等[2]；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是在小麥中污染水平最高的一種倍半萜類化合物，可在食物鏈中長(zhǎng)期存留，對(duì)人類和牲畜的健康造成極大威脅[3-4]。因而赤霉病成為制約我國(guó)乃至世界小麥安全生產(chǎn)的重要因素之一。目前，生產(chǎn)上具有赤霉病抗性的小麥品種較少，施用化學(xué)殺菌劑仍是防控小麥赤霉病最有效和最常用的方法。我國(guó)用于防治小麥赤霉病的藥劑主要有多菌靈、氰烯菌酯、咪鮮胺和甲基托布津、三唑醇、嘧菌酯等殺菌劑及其復(fù)合劑[5-7]。合理使用殺菌劑可有效抑制小麥赤霉病的發(fā)生，對(duì)發(fā)病較為嚴(yán)重的地區(qū)需要多次噴藥以控制赤霉病，抑制其產(chǎn)生的真菌毒素污染糧食。但殺菌劑過量使用會(huì)造成其在小麥中殘留量過大，即防治毒素污染的同時(shí)會(huì)帶來農(nóng)藥殘留的潛在威脅，兩者均為小麥安全生產(chǎn)中的關(guān)鍵危害因子。本研究擬通過噴施不同類型殺菌劑及施藥次數(shù)探索其對(duì)小麥籽粒中真菌毒素污染的防控效果及其殘留風(fēng)險(xiǎn)，旨在尋求小麥赤霉病化學(xué)防控的平衡點(diǎn)，達(dá)到既能有效防治小麥赤霉病毒素污染又能盡可能減少農(nóng)藥殘留的目的，為我國(guó)小麥安全生產(chǎn)及食品安全提供決策依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)

1.1.1 試驗(yàn)藥劑

供試藥劑：50%多菌靈WP(可濕性粉劑)生產(chǎn)于江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；25%氰烯菌酯SC(懸浮劑)生產(chǎn)于江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司；25%咪鮮胺EC(乳油)，江西正邦作物保護(hù)有限公司；70%甲基托布津WP，生產(chǎn)于上海悅聯(lián)化工有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)田分別位于小麥赤霉病發(fā)生較為嚴(yán)重的河南省信陽(yáng)市和湖北省襄陽(yáng)市兩地，試驗(yàn)點(diǎn)土壤肥力中等且基本一致。供試小麥品種為揚(yáng)麥16和揚(yáng)麥20(中感赤霉病品種)，采取直播方式，于2016、2017年連續(xù)兩年開展試驗(yàn)。

使用電動(dòng)噴霧器噴施殺菌劑，第一次噴藥時(shí)間為小麥抽穗后揚(yáng)花率達(dá)10%時(shí)，隔5 d噴第二次，第三和第四次每隔7 d噴藥一次。每種藥劑分別噴施1～4次。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，并設(shè)立保護(hù)隔離行。以等量清水噴霧作為對(duì)照(CK)，兌水量為15～20 L·hm-2,50%多菌靈WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鮮胺EC及70%甲基托布津WP 4種藥劑的用藥量分別為 1.5 kg·hm-2、2.25 L·hm-2、0.9 L·hm-2及 1.5 kg·hm-2。

1.1.3 調(diào)查內(nèi)容與方法

每年六月初待小麥成熟后，各小區(qū)分別采取五點(diǎn)對(duì)角線方式取樣(各點(diǎn)取樣面積為10 m2)，脫粒，經(jīng)晾曬混勻后低溫保存，測(cè)定小麥籽粒DON與殺菌劑殘留量。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 小麥中殺菌劑殘留量檢測(cè)

稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,加10 mL純凈水，30 min后加入10 mL乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司)，振蕩30 min；加入QuEChERS提取鹽包(Part No:5982-0650,美國(guó)安捷倫)，用力振搖2 min，8 000 r·min-1離心5 min；轉(zhuǎn)移8 mL上清液于QuEChERS凈化管，振搖2 min，8 000 r·min-1離心5 min；取2 mL凈化液于50 ℃水浴中氮吹至近干,以甲醇-水(1∶1,v∶v)溶解,混勻并定容至1 mL；過0.22 μm MICRO PES聚醚砜膜，濾液待測(cè)。

儀器條件：超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(UPLC-XEVO TQ,美國(guó)Waters公司),配有電噴霧離子源，液相色譜的色譜柱為ACQUITY BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm,粒徑1.7 μm)， 流速為300 μL· min-1，柱溫為26 ℃,進(jìn)樣體積為5 μL。流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)?～5.5 min,20%～85% A; 5.5～5.8 min,85%～100% A; 5.8～6.0 min,100%～20% A; 6.0 min,20% A,平衡2 min。

質(zhì)譜分析中，應(yīng)用電噴霧離子源(ESI+)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，毛細(xì)管電壓2.50 kV，離子源溫度110 ℃，去溶劑氣流量1 000 L·h-1，去溶劑氣溫度500 ℃。其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

1.2.2 小麥中DON含量檢測(cè)

參照課題組已建立方法對(duì)DON進(jìn)行測(cè)定[8]。DON標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，用甲醇配制成適當(dāng)濃度的母液后置于-20 ℃保存。稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中,加入80%乙腈-水溶液50 mL,180 r·min-1均質(zhì)3 min后，8 000 r·min-1離心5 min；上清液用MycoSep 226多功能凈化柱(Romer，美國(guó))凈化； 取4 mL凈化液于50 ℃水浴中氮吹至近干；以甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨(1∶1,v∶v)溶解,混勻并定容至1 mL；過0.22 μm MICROPES聚醚砜膜(德國(guó)Membrana公司),待測(cè)。

儀器條件：液相色譜的色譜柱為CORTECS C18(100×2.1 mm,1.6 μm),流速為200 μL· min-1,柱溫為40 ℃,進(jìn)樣體積為2 μL。流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.5%甲酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)?～3.5 min,5%～85% A; 3.5～4.5 min,85%～100% A; 4.5～5.0 min,100%～5% A; 5.0 min,5% A,平衡2 min。

質(zhì)譜分析中，應(yīng)用電噴霧離子源(ESI+); 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集; 毛細(xì)管電壓2.50 kV; 離子源溫度110 ℃,去溶劑氣流量800 L·h-1; 去溶劑氣溫度450 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對(duì)真菌毒素DON的防控效果

由圖1可知，在對(duì)照處理下，信陽(yáng)地區(qū)小麥中DON含量高達(dá)3 150 μg·kg-1，顯著高于襄陽(yáng)地區(qū)的污染水平(2 150 μg·kg-1)，表明兩地區(qū)赤霉病的流行程度不同，但DON污染水平均超過國(guó)家限量值(500 μg·kg-1)。多次噴施四種殺菌劑均能顯著降低小麥籽粒中DON累積量(P< 0.05)。其中多菌靈對(duì)DON的防控具有兩面性，噴施50%多菌靈可濕性粉劑1次，小麥籽粒中DON的含量較對(duì)照增加18%(信陽(yáng))、7%(襄陽(yáng))；噴施2～4次，籽粒中DON含量顯著降低，噴施2次為對(duì)照的55.3%(信陽(yáng))、64.5%(襄陽(yáng))；用藥3次，為對(duì)照的24.0%(信陽(yáng))、29.2%(襄陽(yáng))；噴施4次，小麥籽粒中DON含量均較施藥3次降低，其中信陽(yáng)地區(qū)差別不大，而襄陽(yáng)地區(qū)具有顯著差異。

表1 農(nóng)藥和真菌毒素 UPLC-MS/MS測(cè)定參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for determination of pesticides and mycotoxins

25%咪鮮胺噴施1次后兩地小麥中DON均有降低，其中信陽(yáng)地區(qū)小麥中DON含量未呈現(xiàn)顯著性降低，而襄陽(yáng)地區(qū)小麥DON含量降低顯著(P<0.05)；用藥3次后籽粒中DON含量較對(duì)照均顯著降低，較對(duì)照降低了55.1%～64.0%，繼續(xù)增加施藥次數(shù)，DON含量保持穩(wěn)定。25%氰烯菌酯懸浮劑噴施1～4次，小麥籽粒中DON含量降至對(duì)照的42%～58%、29%～49%、 12%～21%及6%～10%，各處理間差異均顯著，對(duì)DON的防控效果可達(dá)90%～94%。70%甲基托布津WP對(duì)籽粒中DON含量的影響與25%氰烯菌酯SC一致，施藥1次籽粒中DON含量較對(duì)照顯著降低，降至對(duì)照的37%～72%(信陽(yáng)地區(qū)小麥中DON污染較為嚴(yán)重)，施藥4次DON降至對(duì)照6%～12%。噴施以上4種殺菌劑3次后，信陽(yáng)地區(qū)除25%咪鮮胺外，其他3種藥劑均能使小麥籽粒中DON的污染水平降至安全限量值 以下。

2.2 噴藥次數(shù)對(duì)小麥籽粒中殺菌劑殘留量的影響

根據(jù)GB 2763-2019《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，小麥中多菌靈、咪鮮胺及甲基托布津的安全限量值均為500 μg·kg-1，氰烯菌酯的臨時(shí)限量值為50 μg·kg-1。由圖2可知，隨著施藥次數(shù)的增加，小麥中4種殺菌劑殘留量均不斷升高，其中以多菌靈殘留量最大。多菌靈用藥4次后，信陽(yáng)、襄陽(yáng)兩地小麥籽粒中的殘留量分別為502.54 μg·kg-1、547.38 μg·kg-1，均超過限量值。

甲基托布津、咪鮮胺與氰烯菌酯在兩地區(qū)使用后的小麥籽粒中殘留量均較小，噴施4次后，甲基托布津的殘留量約60 μg·kg-1，氰烯菌酯的殘留量約30 μg·kg-1，而咪鮮胺殘留水平低于5 μg·kg-1。表明這三種殺菌劑的殘留量對(duì)小麥安全生產(chǎn)影響較小。

2.3 DON含量與殺菌劑殘留量的相關(guān)性分析

由表2可知，信陽(yáng)地區(qū)小麥籽粒中4種殺菌劑的殘留量與DON含量均呈顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，以咪鮮胺殘留量與毒素DON含量負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)。襄陽(yáng)地區(qū)小麥籽粒中除氰烯菌酯外的3種殺菌劑殘留量與DON含量相關(guān)性不顯著。對(duì)兩地區(qū)小麥籽粒中殺菌劑殘留量與所噴施農(nóng)藥次數(shù)進(jìn)行相關(guān)性，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，信陽(yáng)地區(qū)4種農(nóng)藥的施藥次數(shù)與其殘留量均呈現(xiàn)顯著正相關(guān) (P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.932～0.947；襄陽(yáng)地區(qū)咪鮮胺的施藥次數(shù)與其殘留量呈現(xiàn)顯著正相關(guān) (P<0.05)，氰烯菌酯、甲基托布津殘留量與噴施農(nóng)藥次數(shù)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.963與 0.913。

表2 小麥籽粒中殺菌劑藥殘留量與DON含量相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of pesticide residues and DON levels of wheat grain

表3 小麥籽粒中殺菌劑殘留量與施藥次數(shù)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of spray time of 4 kinds of bactericides and pesticide residue amount

3 討 論

本研究中，未采取防控措施時(shí)，信陽(yáng)、襄陽(yáng)兩地小麥籽粒中DON的污染程度均超過國(guó)家限量值，說明在這兩個(gè)地區(qū)小麥揚(yáng)花至成熟期，如不采取恰當(dāng)?shù)姆揽卮胧?huì)嚴(yán)重影響小麥安全生產(chǎn)。兩地區(qū)小麥中DON污染水平有較大差異，信陽(yáng)地區(qū)的污染程度較為嚴(yán)重，可能與流行菌的種類及當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境(如在揚(yáng)花灌漿期的降水量)、作物輪作方式、前茬作物秸稈處理方式以及小麥品種等有關(guān)[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)花期雨水較多會(huì)加重小麥赤霉病的發(fā)生，此外，玉米-小麥輪作也會(huì)加重赤霉病的發(fā)生[10-11]。四種殺菌劑能夠不同程度降低小麥中DON的污染，其中，施用25%多菌靈對(duì)DON的防控效果表現(xiàn)出兩面性，在兩地施用1次后小麥籽粒中DON 的污染量均高于對(duì)照，這可能由于感病菌對(duì)多菌靈有一定抗藥性，DON作為其次生代謝產(chǎn)物，在其生長(zhǎng)過程中受到脅迫刺激而分泌出更高水平的DON毒素。已有大量研究表明，多菌靈對(duì)小麥赤霉病的防控效果逐年下降，鐮刀菌會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定程度的抗藥性[12-14]，如吳佳文等[13]研究發(fā)現(xiàn)，2018年江蘇省部分縣(市、區(qū))分離自小麥穗部的赤霉病菌抗藥菌株頻率為53.18%，其中淮安市寶應(yīng)湖農(nóng)場(chǎng)抗藥頻率高達(dá)90.00%，徐州市豐縣頻率最低，為27.50%，縣域差異達(dá)3.27倍；陳宏州等[14]研究結(jié)果表明，江蘇省小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗性頻率高達(dá)50.58%。成曉松等[15]的研究表明，咪鮮胺、氯啶·戊唑醇、戊唑·咪鮮胺、氰烯菌酯·戊唑醇4種藥劑對(duì)小麥赤霉病有良好的防控效果，防效均在 80%以上，可作為替代多菌靈防治小麥赤霉病，并指出最佳用藥時(shí)間為揚(yáng)花初期，最佳防治間隔為5～7 d。本研究中，噴施2次后，多菌靈與咪鮮胺處理的小麥籽粒中DON含量較氰烯菌酯與甲基托布津處理小麥中DON含量高，以氰烯菌酯的防控效果最佳，施藥3次對(duì)小麥中DON的防控效果可達(dá)78.7%～87.1%。姚克兵等[16]的研究表明，在江淮赤霉病重發(fā)區(qū)，采用25%的氰烯菌酯懸浮劑在小麥揚(yáng)花10%及揚(yáng)花100%各施藥1次(共2次)與抽穗后揚(yáng)花前、揚(yáng)花10%及揚(yáng)花100%各施藥1次(共3次)的處理均能有效防控小麥赤霉病，防控效果達(dá)到80%以上。因而在小麥生產(chǎn)中，尤其是江蘇、安徽等小麥赤霉病發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)，當(dāng)赤霉病菌對(duì)多菌靈抗藥性頻率較高時(shí)，建議用新型高效殺菌劑以有效防控小麥赤霉病。

噴施殺菌劑可有效防控小麥赤霉病等病害的發(fā)生、降低真菌毒素的污染，然而殺菌劑又會(huì)帶來小麥中殺菌劑殘留的安全隱患。本研究發(fā)現(xiàn)，4種殺菌劑于小麥揚(yáng)花期噴施2次的小麥籽粒中多菌靈殘留含量最高，且超過國(guó)家糧食安全限量值，其他3種殺菌劑殘留均沒超過國(guó)家糧食安全限量值。刁春友等[17]在小麥抽穗揚(yáng)花期使用多菌靈、氰烯菌酯等11種當(dāng)前生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的藥劑，施藥2次的小麥籽粒中僅發(fā)現(xiàn)多菌靈、氟環(huán)唑、甲基硫菌靈3種農(nóng)藥，其余農(nóng)藥基本檢測(cè)不到。這與本研究結(jié)論一致。氰稀菌酯(JS399-19)作為一種新型合成化合物,對(duì)鐮孢菌具有較高的?；钚裕瑲⒕钚愿?，不僅可以有效降低小麥籽粒中DON毒素含量，且在籽粒中殘留較少[18]。表明氰烯菌酯對(duì)小麥赤霉病的防控效果最佳。

研究發(fā)現(xiàn)，兩地區(qū)4種殺菌劑噴施次數(shù)與其在小麥籽粒中的殘留量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而殺菌劑殘留量與DON的污染程度呈現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)性。信陽(yáng)地區(qū)4種殺菌劑在籽粒中的殘留量與DON含量均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，襄陽(yáng)地區(qū)小麥籽粒中有3種殺菌劑殘留量與DON含量相關(guān)性不顯著。出現(xiàn)這種情況的原因可能與不同地區(qū)的溫度、濕度及栽培耕作制度及發(fā)病菌種等相關(guān)[19-21]：(1)小麥生長(zhǎng)環(huán)境條件，如溫度、濕度及輪作方式，或者后期采收儲(chǔ)運(yùn)過程，均會(huì)影響毒素的累積水平，從而導(dǎo)致不同地區(qū)小麥中毒素的含量差異較大，與農(nóng)殘含量的相關(guān)性不太一致；(2)毒素的累積水平與真菌的產(chǎn)毒能力有關(guān)，不同地區(qū)流行的赤霉病菌種可能不同，因而即使小麥赤霉病發(fā)病程度相似，但毒素的累積水平仍能表現(xiàn)出較大差異。整體而言，殺菌劑的使用次數(shù)即殺菌劑使用量與DON的防控效果呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但是過多使用殺菌劑尤其是多菌靈又會(huì)造成其殘留超標(biāo)問題，因而如何正確把小麥真菌毒素污染防控與殺菌劑殘留風(fēng)險(xiǎn)控制在一個(gè)安全有效的平衡點(diǎn)在小麥安全生產(chǎn)中至關(guān)重要。本研究中，4種殺菌劑施藥2～3次后對(duì)DON的防控可達(dá)到安全范圍內(nèi)，繼續(xù)增加施藥次數(shù)對(duì)DON防控效果沒有顯著增加。在實(shí)際生產(chǎn)中，要根據(jù)小麥赤霉病的發(fā)病程度合理施用殺菌劑，在保證對(duì)赤霉病有效防控的基礎(chǔ)上盡量減少用量以保證小麥的安全生產(chǎn)。

4 結(jié) 論

50%多菌靈WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鮮胺EC、70%甲基托布津WP 4種不同類型的殺菌劑對(duì)小麥赤霉病均有一定的防治效果，隨著施藥次數(shù)的增加， 小麥籽粒中DON含量呈下降趨勢(shì)。在4種殺菌劑中，氰烯菌酯對(duì)DON的防控效果最佳且殘留水平較低；多菌靈對(duì)DON的防控效果較低且殘留量最大。