高效液相色譜法測定復(fù)方氨酚美沙糖漿中抑菌劑含量

蔡錦雄，龐賽，梁愛仙，劉敏，李玉蘭，王鐵杰

深圳市藥品檢驗研究院，深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣東 深圳 518057

復(fù)方氨酚美沙糖漿為復(fù)方抗感冒藥，臨床用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕和咳嗽等癥狀?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)（第三冊）［1］，但未對抑菌劑的含量進行規(guī)定。在含糖量較低的糖漿劑中，通常需要加入抑菌劑，防止出現(xiàn)霉敗現(xiàn)象，在本制劑中，添加的抑菌劑為苯甲酸鈉和羥苯甲酯。糖漿劑中的抑菌劑用量不足時，可能導(dǎo)致制劑霉敗；而過量時，可能產(chǎn)生毒性［2-13］。因此，需要關(guān)注糖漿劑中抑菌劑的用量問題。本研究參考文獻［14-15］方法，建立高效液相色譜法（HPLC）測定復(fù)方氨酚美沙糖漿中苯甲酸鈉和羥苯甲酯的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；XS205DU 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Reference 純水器（德國默克公司）。

1.2 材料

苯甲酸鈉對照品（批號：100047-201507，含量：99.7%）、羥苯甲酯對照品（批號：100047-201507，含量：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、三乙胺為色譜純，磷酸二氫鉀、己烷磺酸鈉、磷酸為分析純；水為超純水；復(fù)方氨酚美沙糖漿（國內(nèi)某公司，批號19111712、19111812、19111912，規(guī)格：120 mL/瓶，苯甲酸鈉含量：1 mg/mL，羥苯甲酯含量：1 mg/mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鉀6.8 g、己烷磺酸鈉0.565 g，加三乙胺2 mL，加水1 000 mL 溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.3）為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1 進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為215 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取苯甲酸鈉對照品和羥苯甲酯對照品各適量，精密稱定，加溶劑（流動相A-流動相B（85∶15）溶解并定量稀釋制成每1 mL 含苯甲酸鈉0.1 mg 和羥苯甲酯0.1 mg 的混合溶液，搖勻，棄去初濾液2 mL，取續(xù)濾液。

2.2.2 供試品溶液用內(nèi)容量移液管精密量取本品1 mL，置10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，棄去初濾液2 mL，取續(xù)濾液。

2.2.3 陰性樣品溶液參照復(fù)方氨酚美沙糖漿配方比例和制備工藝，制備缺2 種防腐劑的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，分別見圖1。圖譜顯示，對照品溶液和供試品溶液中，各組分與相鄰色譜峰分離度均大于3.3，理論板數(shù)均大于50 000，表明該方法系統(tǒng)適用性良好。陰性樣品溶液在2 種抑菌劑相應(yīng)色譜峰位置，均未見色譜峰，表明陰性樣品無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系

取苯甲酸鈉對照品和羥苯甲酯對照品各適量，精密稱定，加溶劑溶解，定量稀釋制成每1 mL 含苯甲酸鈉0.2 mg 和羥苯甲酯0.2 mg 的混合對照品貯備溶液，分別取混合對照品貯備溶液0.50、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5 mL，分別置10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的線性溶液。取上述溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以各成分質(zhì)量濃度（x,mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 回歸方程與線性范圍

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣測定5 次，記錄各色譜峰面積。結(jié)果顯示，苯甲酸鈉和羥苯甲酯峰面積的RSD 均為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 回收率試驗

用內(nèi)容量移液管精密量取9 份“2.2.3”項下的陰性樣品1 mL，分別置10 mL 量瓶中，分別精密加入“2.4”項下的混合對照品貯備溶液4、5、6 mL（各3 份），加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得相對濃度為80%、100%、120%的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算其含量及回收率，結(jié)果見表3，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表3 回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.7 重復(fù)性試驗

取本品（批號19111712）6 份，按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，6 份供試品溶液中苯甲酸鈉和羥苯甲酯的含量分別為100.4%和99.4%，RSD 分別為0.3%和0.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下的對照品溶液和供試品溶液，在樣品倉溫度為15 ℃條件下，考察0、24、50 h，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果，苯甲酸鈉和羥苯甲酯峰面積的RSD 均不大于1.5%。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液在15 ℃下50 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

取3 批復(fù)方氨酚美沙糖漿樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖并按外標(biāo)法以峰面積計算樣品中抑菌劑的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品抑菌劑含量測定結(jié)果（%）

3 結(jié)果

本試驗在“2.1”擬定的色譜條件下，考察了有機相流動相比例（15%±2%）、流速（1.0±0.1 mL/min）、柱溫（30±2 ℃）、波長（215±2 nm）的影響，結(jié)果顯示，2 種抑菌劑與相鄰色譜峰分離度均不小于3.0。擬定測定條件的小變動能滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，表明該方法具有較好的耐用性。

本試驗考察了苯甲酸鈉和羥苯甲酯的濾膜吸附情況，采用微孔濾膜（品牌：津騰，材質(zhì)：尼龍66，直徑：13 mm，孔徑：0.45 μm）分別棄去初濾液0、1、2、3、4、5 mL 后作為待測溶液，以離心處理的溶液作為無吸附溶液，計算各待測溶液與無吸附溶液峰面積計算相對偏差。結(jié)果顯示，在對照品溶液和供試品溶液中，濾膜對各組分的吸附性結(jié)果一致；除在棄去0 mL 時，羥苯甲酯的相對偏差大于2.0%外，其余相對偏差結(jié)果均小于2.0%。結(jié)果表明，溶液在使用微孔濾膜過濾時，應(yīng)至少棄去1 mL初濾液。

4 討論

本試驗建立了HPLC 法測定2 種抑菌劑苯甲酸鈉和羥苯甲酯含量的方法，方法操作簡單、專屬性強、準(zhǔn)確度高，為復(fù)方氨酚美沙糖漿的質(zhì)量控制提供了參考方法。