新型冠狀病毒核酸檢測及生物安全防護(hù)實踐

摘要：目的：通過新型冠狀病毒核酸檢測實踐，探討通過鼻咽拭子和咽拭子測新型冠狀病毒的質(zhì)量管理和生物安全防護(hù)。方法 采集 2020 年12月-2021年4月在我院進(jìn)行核酸檢測的人員的咽拭子、鼻咽拭子等樣本共5625例，環(huán)境檢測樣本321例，食品檢測樣本415例。采用實時熒光定量 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒開放讀碼框 1ab（ORF1ab）、核衣殼蛋白（N）基因[3]。結(jié)果：1844 例樣本中，檢測出陽性病例 0 例。結(jié)論：嚴(yán)格的質(zhì)量控制和有效的生物安全防護(hù)保證了新冠核酸檢測安全高效的開展，及時準(zhǔn)確的檢測結(jié)果為新冠肺炎的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒;核酸檢測;質(zhì)量控制;生物安全防護(hù)

【中圖分類號】R563.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）04-334-02

新冠肺炎（corona viruS diSeaSe 19，COVID-19）是由新型冠狀病毒所感染所致的肺部炎癥，自2019年12月份在武漢被發(fā)現(xiàn)以后，迅速形成大流行趨勢，蔓延全國，具體病毒起源現(xiàn)在還未知，但是由于其傳染性強(qiáng)，易感人群范圍廣[4.5]。再加上自2020年以來，全國多地冷鏈?zhǔn)称繁粰z測出新型冠狀病毒，甚至出現(xiàn)物傳人現(xiàn)象，因此國家要求對來自外省的人員以及出入境人員和冷鏈?zhǔn)称废到y(tǒng)進(jìn)行核酸檢測，以防止新冠肺炎的二次暴發(fā)[6]。

核酸檢測能夠有效的檢測出新冠病毒感染者，對感染者采取強(qiáng)制隔離措施能夠有效抑制疫情的傳播，由于國內(nèi)多次出現(xiàn)冷鏈系統(tǒng)出現(xiàn)檢測陽性的案例，因此加重了國內(nèi)對冷鏈?zhǔn)称芬约碍h(huán)境的核酸檢測，防止出現(xiàn)物傳人的現(xiàn)象[1.2]。此外，由于國外疫情的加重和變異病毒株類型的增加，國內(nèi)的疫情防控也不可掉以輕心[7]。

1.材料與方法

1.1研究對象

本中心選取的研究對象主要分為以下三部分：

第一部分：由我中心進(jìn)行核酸檢測的人群。選取自2020年12月-2021年4月來我中心進(jìn)行核酸檢測的人員樣本5625例。人員包括有高、中風(fēng)險地區(qū)返回本縣的人群、出入境人群、縣級、鄉(xiāng)鎮(zhèn)的醫(yī)務(wù)人員、養(yǎng)老院人員、公安干警等應(yīng)檢盡檢人群等。

第二部分：由我中心進(jìn)行核酸檢測的食品樣本。選取自2020年12月-2021年4月由我中心所檢測的食品樣本415例，包括進(jìn)口的食品樣。

第三部分：由我中心進(jìn)行核酸檢測的環(huán)境樣本。選取自2020年12月-2021年4月由我中心檢測的環(huán)境樣本321例。環(huán)境樣本包括冷鏈系統(tǒng)環(huán)境以及其他高風(fēng)險環(huán)境。

1.2方法

1.2.1 樣本采集方法

（1）人群采樣方法

采用預(yù)約模式集中采樣及各鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院采樣后集中送我中心檢測 每日檢測時間主要集中為下午時段。我中心檢驗檢測人員經(jīng)市級以上核酸檢測培訓(xùn)合格且有合格證后方可上崗。嚴(yán)格按照國家規(guī)定對前來檢測的人員進(jìn)行核酸檢測。本中心采用的采樣方法主要有鼻咽拭子和咽拭子兩種采樣方法。每個病例采集鼻咽拭子，對多次檢測陰性或高度疑似的患者，由臨床醫(yī)生根據(jù)需要采集鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或肛拭子等[8]。

具體步驟：采樣人員以右手執(zhí)拭子，左手按住受試者的頭頂部固定住。使頂端稍向下彎的拭子自前鼻孔進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，動作應(yīng)輕柔緩慢，切不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時（有碰壁觸感），將拭子稍留片刻（約3秒左右），然后輕輕旋轉(zhuǎn)一周，緩緩取出拭子?？扇×?根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔，將上述2根拭子浸入同一含3ml病毒采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。按生物安全要求包裝好后，應(yīng)盡快運送到我中心實驗室進(jìn)行病毒核酸檢測[9]。

（2）食品采樣方法

按照采樣規(guī)范對食品進(jìn)行核酸檢測。①優(yōu)先采集有明顯病變器官組織;②水產(chǎn)品應(yīng)優(yōu)先采取帶有內(nèi)臟及其周邊組織樣品;③同一動物按照上表所列樣品類型順序依次采集，表面涂抹須同時進(jìn)行。④同一動物最多采集不超過 3 個樣品：⑤每個樣品采集兩份，一份檢樣，一份備樣。除了表面涂抹拭子按正常操作以外，組織需進(jìn)行均質(zhì)（均質(zhì)也稱勻漿，是使懸浮液（或乳化液）體系中的分散物微?；⒕鶆蚧奶幚磉^程，這種處理同時起降低分散物尺度和提高分散物分布均勻性的作用）后，再進(jìn)行正常核酸檢測操作[10]。

（3）環(huán)境采樣方法

按照國家規(guī)定，定期對運輸冷鏈?zhǔn)称穲鏊M(jìn)行環(huán)境采樣。采樣時手指應(yīng)握住采集拭子頭另一端的頂部，蘸取病毒采樣液使采集拭子濕潤，在需要采集的物體表面的適當(dāng)部位來回均勻涂抹，同時轉(zhuǎn)動采集拭子。涂抹完成后將拭子頭置入管中，拭子折斷點置于管口處，稍用力折斷使拭子頭落入采集管的液體中，將手握部分的拭子桿扔到醫(yī)療廢物垃圾袋中，旋緊管蓋，在采集管上貼標(biāo)簽，標(biāo)注樣本編號，將采集管置于穩(wěn)定的置物架上[11]。

1.2.2實驗室檢測方法

（1）防護(hù)要求：1 進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行實驗操作可采取一級生物安全防護(hù)措施?2進(jìn)入樣本制備區(qū)進(jìn)行核酸提取的實驗操作應(yīng)采取三級生物安全防護(hù)措施。

（2）操作流程：1 每次開始實驗前，選派兩組實驗人員（第一組2人，第二組1-2人）第一組采取生物安全三級防護(hù)進(jìn)入樣本制備區(qū)，第二組采取一級生物安全防護(hù)進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)

（3）樣本整理：第一組檢測人員進(jìn)入樣本制備區(qū)后，依次打開生物安全柜、核酸提取儀，保持生物安全柜運行5分鐘后，在生物安全柜內(nèi)打開標(biāo)本運輸箱取出待檢樣本，酒精消毒樣本后移入56度水浴箱滅活30分鐘。

（4）核酸提取步驟：自動化儀器儀器提取，（儀器GeneRotex 96 試劑西安天隆科技有限公司提取試劑）試劑使用參照廠家說明書。

（5）PCR擴(kuò)增試劑配制：第二組檢測人員采取一級生物安全防護(hù)進(jìn)入試劑準(zhǔn)備室將試劑盒各組分置生物安全柜內(nèi)融化，充分混勻后瞬間離心。計算試劑使用份數(shù)N（N=樣本份數(shù)+陽性對照份數(shù)+陰性對照份數(shù)），根據(jù)試劑盒說明書單份試劑配制表在適當(dāng)體積離心管中配制檢測樣本反應(yīng)體系，充分混勻后瞬間離心，分裝至PCR反應(yīng)板，通過傳遞窗移至樣本制備區(qū)，由第一組檢測人員按照擴(kuò)增試劑盒要求加入相應(yīng)體積已經(jīng)提取的RNA、陰性對照、陽性對照于反應(yīng)板內(nèi)。將加完樣品并蓋好蓋子的反應(yīng)板傳遞到PCR擴(kuò)增區(qū)

（6）擴(kuò)增檢測與結(jié)果分析：將反應(yīng)板放于熒光定量PCR儀（QuanStudio 5 試劑上海伯杰）按試劑盒說明書設(shè)置相應(yīng)擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，在儀器正常、陽性對照、陰性對照均正常的情況下進(jìn)行結(jié)果分析。

（7）結(jié)果報告：7.1結(jié)果報告根據(jù)試劑盒說明書中質(zhì)量控制要求、擴(kuò)增曲線、結(jié)果判讀規(guī)則綜合判斷檢測結(jié)果7.2按照《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第七版）》附件六要求，實驗室要確認(rèn)一個病例為陽性，滿足以下條件的其中一個：1 同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個靶標(biāo)（ORF1ab病毒開放讀碼框、N核殼蛋白）特異性實時熒光檢測結(jié)果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測。如果仍然為單靶陽性，判定為陽性。2兩種標(biāo)本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測中均出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。

1.2.2實驗室消毒方法

（1）每日在進(jìn)行核酸檢測后，需嚴(yán)格對PCR各區(qū)域及走廊進(jìn)行消毒處理，使用紫外燈進(jìn)行消毒1小時。

（2）每天使用的消毒液必須為新鮮配置，配置時間小于24小時。

（3）檢測結(jié)束后需對生物安全柜消毒。使用紫外光燈進(jìn)行消毒，消毒時間大于1小時。

（4）對于樣本放置采用75%濃度的酒精進(jìn)行徹底消毒，防止樣本泄露。

（5）實驗過程中用到的移液器、操作臺、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀等儀器設(shè)備用75%的酒精擦拭。

（6）消毒完畢后，再打開窗戶進(jìn)行通風(fēng)。

（7）若檢測到陽性樣本，采用 7.5%過氧化氫噴霧對實驗室進(jìn)行終末消毒。

（8）工作結(jié)束時將所有的醫(yī)療廢棄物用醫(yī)療包裝袋雙層包裝好，扎口，置于高壓蒸汽滅菌器中高壓滅菌后集中處理，消毒措施記錄于實驗室消毒登記表中[12]。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用描述性分析對本階段的核酸檢測工作進(jìn)行描述分析。

2.結(jié)論

2.1數(shù)據(jù)結(jié)論：

（1）根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)論可知我國在2020年全年對于新冠肺炎疫情的控制措施非常好，本次實踐結(jié)果沒有出現(xiàn)陽性患者及病例。

（2）人員檢測技術(shù)較為成熟，一次檢測率高，極大地減少了人員多次檢測的痛苦。

（3）本中心的疫情防控工作和消毒工作嚴(yán)格按照國家規(guī)定執(zhí)行，本檢測中心未出現(xiàn)院內(nèi)感染事例。

（4）對于食品以及環(huán)境檢測的方法以及流程較為熟練。

3.討論

由于國外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)變異菌株，因此在進(jìn)行核酸檢測時，針對國外入境人員要實施嚴(yán)格的隔離手段，并且多次檢測核酸，以防止漏查而造成嚴(yán)重后果，通過閱讀文獻(xiàn)我們可知不同的檢測手段所檢測出的結(jié)果不同，因此我們在實際應(yīng)用時要注意檢測方法的應(yīng)用。對于檢測全程我們要注意環(huán)境的消毒和醫(yī)務(wù)人員的防護(hù)措施。防止因醫(yī)務(wù)人員的失誤而造成疫情的傳播[13]。對于新冠疫苗的接種要進(jìn)行普及以防止疫情的再次蔓延。

綜上，嚴(yán)格的質(zhì)量控制和有效的生物安全防護(hù)保證了新冠核酸檢測安全高效的開展，及時準(zhǔn)確的檢測結(jié)果為新冠肺炎的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。

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作者簡介：馮忠游（1982-）男，漢族，南丹縣，本科，工作方向：臨床醫(yī)學(xué)檢驗。

南丹縣疾病預(yù)防控制中心?廣西河池?547200