基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與先天性巨結(jié)腸發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展

韓璐，姜茜

(首都兒科研究所遺傳研究室，北京 100020)

先天性巨結(jié)腸(在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)編碼，OMIM：142623)是由神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖、分化或遷移異常所致的一種多基因遺傳病[1-2]。其臨床表現(xiàn)為腸道蠕動(dòng)能力減弱、低位腸梗阻、頑固性便秘、腹脹等，部分病例伴有并發(fā)癥，嚴(yán)重者不及時(shí)治療可導(dǎo)致死亡；主要病理特征為腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失[3]。根據(jù)受累腸段的范圍不同先天性巨結(jié)腸可分為短段型(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失的腸段不超過(guò)乙狀結(jié)腸近端)、長(zhǎng)段型(痙攣狹窄段延至降結(jié)腸甚至橫結(jié)腸)和全結(jié)腸型(痙攣狹窄段波及升結(jié)腸及距回盲部30 cm以?xún)?nèi)的回腸)[2]。來(lái)自迷走神經(jīng)或骶神經(jīng)的神經(jīng)嵴細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)一系列基因表達(dá)調(diào)控最終分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，由其組成的復(fù)雜系統(tǒng)構(gòu)成腸神經(jīng)系統(tǒng)[4-5]。腸道神經(jīng)元及其前體細(xì)胞譜系的適度增殖、平衡分化以及順利遷移是腸神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育的前提條件[6]，這一過(guò)程涉及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中關(guān)鍵基因發(fā)生的編碼區(qū)突變或非編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性風(fēng)險(xiǎn)等位基因累積所致的基因表達(dá)異常等均可導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸的發(fā)生。明確先天性巨結(jié)腸疾病的致病基因有利于為先天性巨結(jié)腸的預(yù)防、診斷、治療方案提供充分的證據(jù)，為疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)遺傳咨詢(xún)提供科學(xué)的指導(dǎo)?，F(xiàn)就基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與先天性巨結(jié)腸發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期的細(xì)胞增殖與分化

1.1以性別決定區(qū)盒基因10(SRY-box transcription factor 10，SOX10)為核心的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) SOX10是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)決定過(guò)程。其編碼的蛋白質(zhì)在與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后可作為轉(zhuǎn)錄激活劑，該蛋白作為一種核質(zhì)穿梭蛋白，對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。Taylor等[7]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴細(xì)胞早期表達(dá)SOX10，并對(duì)Notch和內(nèi)皮素3/G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體信號(hào)通路做出反應(yīng)，這些因子使祖細(xì)胞在增殖的過(guò)程中始終保持未分化狀態(tài)，見(jiàn)圖1。SOX10、內(nèi)皮素受體B基因(endothelin receptor type B，EDNRB)、內(nèi)皮素3基因突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的綜合征型先天性巨結(jié)腸(OMIM：277580)，患者的典型表現(xiàn)是皮膚或虹膜色素沉著異常、感音神經(jīng)性耳聾伴先天性巨結(jié)腸[8-9]。Sribudiani等[10]指出，SOX10還會(huì)與SUFU刺猬信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)基因(SUFU negative regulator of hedgehog signaling，SUFU)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤原癌基因家族(glioma-associated oncogene homolog，GLI)構(gòu)成基因調(diào)控環(huán)路，調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化和遷移。其中，SUFU編碼Hedgehog信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子與模式生成和細(xì)胞增殖有關(guān)。GLI1編碼的轉(zhuǎn)錄因子被Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖。Han等[11]發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)在人類(lèi)胎兒器官形成期會(huì)與Wnt信號(hào)一起觸發(fā)并決定包括腸道在內(nèi)的多種器官的形成方式和形成時(shí)間。GLI3作為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，是Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)，與胚胎發(fā)育密切相關(guān)[12]。Liu等[13]對(duì)先天性巨結(jié)腸患者的深度靶向測(cè)序發(fā)現(xiàn)了GLI1、GLI2、GLI3、SUFU、SOX10基因的多種突變。Matera等[14]利用N-乙基-N-亞硝基脲突變篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gli3可作為Sox10神經(jīng)損傷的修飾因子，在小鼠胚胎期第11.5天，Gli3的無(wú)義突變雖然不會(huì)影響野生型小鼠的正常發(fā)育，但會(huì)顯著增加Sox10基因缺陷小鼠異常表型的嚴(yán)重程度，包括黑色素細(xì)胞減少和腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。該研究也表明，在決定表型嚴(yán)重程度時(shí)，主要致病基因的作用可以被特定修飾因子調(diào)節(jié)。Sufu是Gli的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控因子[15-16]，Sufu突變體中Gli的轉(zhuǎn)錄活性得到明顯增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致祖細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定，促進(jìn)腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化。Gli家族分子的活性直接決定最終腸神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的比例，Sufu突變會(huì)增加Gli轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞比例增加，神經(jīng)元比例降低[13]，見(jiàn)圖1。

1.2以印度刺猬信號(hào)分子(Indian hedgehog signaling molecule，IHH)基因和鋅指E盒結(jié)合同源蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)基因?yàn)楹诵牡幕虮磉_(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) IHH基因也參與編碼Hedgehog家族分子的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子GLI3編碼IHH的中間體，GLI3和IHH基因編碼區(qū)的錯(cuò)義突變均已在部分先天性巨結(jié)腸患者中被檢測(cè)到[10]。Sribudiani等[10]發(fā)現(xiàn)向斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)注射IHH阻斷劑嗎啉代后，其腸道神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，說(shuō)明IHH可調(diào)控腸道神經(jīng)元的發(fā)育。

ZEB2在神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為具有雙向潛能的祖細(xì)胞之前的胚胎發(fā)育早期作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)神經(jīng)、神經(jīng)外胚層和中胚層譜系的發(fā)育[17]。ZEB2基因單倍劑量不足會(huì)導(dǎo)致源自神經(jīng)和神經(jīng)外胚層譜系的綜合征，包括先天性巨結(jié)腸、智力低下、面容異常等特征，即Mowat-Wilson綜合征(OMIM：235730)[18-19]。Birkhoff等[20]研究表明，ZEB2的表達(dá)有時(shí)間和組織特異性，轉(zhuǎn)錄因子SOX10和HOXB2通過(guò)與ZEB2基因上的3個(gè)增強(qiáng)子結(jié)合參與這種特異性的調(diào)控。

2 腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中期的細(xì)胞增殖與分化

2.1成對(duì)樣同源框2B(paired like homeobox 2B，PHOX2B)基因與SOX10基因調(diào)控細(xì)胞分化方向 PHOX2B基因3號(hào)外顯子內(nèi)丙氨酸重復(fù)擴(kuò)增突變是導(dǎo)致先天性中樞性低通氣綜合征的主要原因[20]。先天性中樞性低通氣綜合征患者發(fā)生先天性巨結(jié)腸和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的概率分別是正常人群患病率的1 000倍和500～1 000倍[21]。在合并先天性巨結(jié)腸和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的先天性中樞性低通氣綜合征患者中，多數(shù)攜帶PHOX2B基因的錯(cuò)義突變或由堿基插入、缺失引起的移碼突變[22]。Young等[23]發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)，迷走神經(jīng)或骶神經(jīng)嵴細(xì)胞來(lái)源的未分化的祖細(xì)胞在進(jìn)入前腸間質(zhì)時(shí)即開(kāi)始持續(xù)表達(dá)Phox2b、酪氨酸激酶受體原癌基因Ret等。Nagashimada等[24]通過(guò)在小鼠Phox2b基因座中引入非丙氨酸重復(fù)擴(kuò)增突變(931 del5；693-700 del8)，成功誘導(dǎo)出與先天性巨結(jié)腸和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者相似的異常表現(xiàn)。該突變降低了野生型Phox2b在其已知靶點(diǎn)多巴胺羥化酶上的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，將Phox2b對(duì)Sox10增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄作用從轉(zhuǎn)錄阻遏轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活，使Sox10的表達(dá)量顯著升高。從胚胎第15天開(kāi)始，雙潛能祖細(xì)胞開(kāi)始分化為膠質(zhì)細(xì)胞(Phox2b-,Sox10+)或神經(jīng)細(xì)胞(Phox2b+,Sox10-)；至胚胎第12天，TuJ1+神經(jīng)元前體細(xì)胞應(yīng)停止表達(dá)Sox10，但在突變型小鼠的TuJ1+神經(jīng)元前體細(xì)胞中Sox10仍持續(xù)高表達(dá)，提示Phox2b基因的這一功能獲得性突變和由此所致的Sox10基因表達(dá)異常升高可能與先天性巨結(jié)腸的易感性增加有關(guān)[24-25]，見(jiàn)圖1。

PHACTR4：磷酸酶和肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子4；ROCK：Rho相關(guān)蛋白激酶；PPI：蛋白激酶1；Itgb1：整合素亞基β1；COL6A：Ⅵ型膠原蛋白α鏈；PHOX2B：成對(duì)樣同源框2b；SOX10：性別決定區(qū)盒基因10；RET：酪氨酸激酶受體原癌基因；ET-3：內(nèi)皮素3；ETB：G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體；NGFR：神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體；Ki67：由單克隆抗體ki67鑒定的抗原；EDNRB：內(nèi)皮素受體B；EDN3：內(nèi)皮素3基因；GLI3：神經(jīng)膠質(zhì)瘤原癌基因家族3；SUFU：SUFU刺猬信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)基因；Ascl1：achaete-scute family bHLH transcription factor 1；PTCH1：補(bǔ)丁基因1；DLL3：Delta樣經(jīng)典N(xiāo)otch配體3；GDNF:神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；GFRα1：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族受體α1；CBL：卡西塔斯B系淋巴瘤原癌基因；GATA2：GATA 結(jié)合受體2；NKX2-5：NK2同源框5；RARB：視黃酸受體β；GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白；HuC/D：RNA結(jié)合蛋白HuC/RNA結(jié)合蛋白HuD；Tuj1：Ⅱβ-Tubulin

2.2Hedgehog/Notch誘導(dǎo)的過(guò)早膠質(zhì)細(xì)胞生成 腸道膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)早生成可通過(guò)降低神經(jīng)嵴細(xì)胞祖細(xì)胞的比例減少神經(jīng)元數(shù)量。Ngan等[26]對(duì)先天性巨結(jié)腸患者的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)丁基因1(patched 1，PTCH1)和Delta樣經(jīng)典N(xiāo)otch配體(Delta like canonical Notch ligand,DLL)3基因內(nèi)的系列特定單核苷酸多態(tài)性與較高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。小鼠腸神經(jīng)嵴細(xì)胞中Ptch1的缺失可誘導(dǎo)Dll1高表達(dá)和Notch信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致突變腸道中過(guò)早生成膠質(zhì)細(xì)胞和腸神經(jīng)嵴細(xì)胞祖細(xì)胞的減少[26]。Dll1是Hedgehog的配體，在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮整合Hedgehog、Notch通路以協(xié)調(diào)神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分化水平的作用。此外，Hedgehog家族分子功能異常還與人類(lèi)神經(jīng)嵴細(xì)胞相關(guān)前體細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成有關(guān)。因此認(rèn)為，PTCH1和DLL3是先天性巨結(jié)腸的疾病易感基因，Hedgehog/Notch誘導(dǎo)的過(guò)早膠質(zhì)細(xì)胞生成可能是先天性巨結(jié)腸的發(fā)病機(jī)制之一，見(jiàn)圖1。

2.3以RET為核心的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)-GDNF家族受體α1(GDNF family receptor-α1，GFRα1)-RET信號(hào)通路對(duì)雙潛能祖細(xì)胞的增殖、分化、遷移均有重要作用，見(jiàn)圖1。RET基因編碼的受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及神經(jīng)嵴衍生的器官和組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用。GDNF基因編碼其配體，GFRα1基因編碼共受體。實(shí)驗(yàn)表明，GDNF可通過(guò)調(diào)控祖細(xì)胞的增殖來(lái)控制腸道神經(jīng)元的數(shù)量，在Gdnf純合缺失小鼠中，腸道廣泛出現(xiàn)神經(jīng)元缺失，但是胃和食管神經(jīng)元的數(shù)量均未受到影響[27]。食管神經(jīng)元、一過(guò)性?xún)翰璺影纺芗?xì)胞、由一過(guò)性?xún)翰璺影纺芗?xì)胞發(fā)育而成的神經(jīng)細(xì)胞均為Ascl1(achaete-scute family bHLH transcription factor 1)依賴(lài)的，而腸道神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞是非Ascl1依賴(lài)的，盡管它們都起源于迷走神經(jīng)或骶神經(jīng)嵴的祖細(xì)胞[1,7,28]，見(jiàn)圖1。部分先天性巨結(jié)腸患者攜帶GDNF突變；利用HEK293細(xì)胞系進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，GDNF的缺失抑制了其基因產(chǎn)物的分泌，RET表達(dá)水平亦顯著下降[10]。Soret等[29]使用GDNF對(duì)具有先天性巨結(jié)腸表型的出生后小鼠進(jìn)行灌腸治療，觀察到腸道神經(jīng)元(腸肌層HuC/D+神經(jīng)元)和膠質(zhì)細(xì)胞(Sox10+)再生以及腸道蠕動(dòng)功能顯著恢復(fù)；向從先天性巨結(jié)腸患者體內(nèi)分離培養(yǎng)的病變段結(jié)腸組織中添加GDNF也能觀察到神經(jīng)元的明顯再生現(xiàn)象；此外，神經(jīng)相關(guān)施旺細(xì)胞(Ki67+SOX10+)作為腸神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的前體，其增殖和遷移作用也得到顯著恢復(fù)。

先天性巨結(jié)腸的主要致病基因RET編碼一種跨膜酪氨酸激酶，當(dāng)其配體GDNF與共受體GFRα1結(jié)合時(shí)可被激活[30]。RET基因功能異常主要由編碼區(qū)罕見(jiàn)變異及非編碼區(qū)常見(jiàn)增強(qiáng)子變異引起，這些變異可在至少48.4%的先天性巨結(jié)腸患者中被檢出[2]。其中，至少90%的短段型先天性巨結(jié)腸患者攜帶RET基因非編碼區(qū)變異[31]，約35%的長(zhǎng)段型先天性巨結(jié)腸患者攜帶RET基因編碼區(qū)罕見(jiàn)變異。Lai等[32]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)段型先天性巨結(jié)腸患者來(lái)源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞RET G731del細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的遷移障礙和腸道神經(jīng)元分化異常，突變修正后，遷移和分化能力均得到顯著恢復(fù)。RET所在的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是先天性巨結(jié)腸發(fā)生的關(guān)鍵限速步驟，這一過(guò)程也涉及非自主因素，如GDNF不是由腸神經(jīng)嵴細(xì)胞表達(dá)，而是由腸道間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[33]，見(jiàn)圖1。Emison等[34]認(rèn)為RET內(nèi)含子在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也發(fā)揮作用：內(nèi)含子區(qū)變異可通過(guò)改變RET基因表達(dá)量增加先天性巨結(jié)腸的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。以RET基因內(nèi)含子中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2435357為例，在先天性巨結(jié)腸患者隊(duì)列檢出“T”等位基因的頻率遠(yuǎn)高于正常人群。該風(fēng)險(xiǎn)等位基因可通過(guò)破壞SOX10與增強(qiáng)子的結(jié)合作用降低RET的信使RNA表達(dá)，使先天性巨結(jié)腸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加4倍。Kapoor等[35]發(fā)現(xiàn)在歐洲高加索患者中，RET(rs2435357、rs2506030)和軸突導(dǎo)向因子3A(rs11766001)基因內(nèi)部的3個(gè)常見(jiàn)、低外顯率的非編碼區(qū)變異可導(dǎo)致短段型先天性巨結(jié)腸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，風(fēng)險(xiǎn)等位基因的效應(yīng)與患者所攜帶的風(fēng)險(xiǎn)等位基因數(shù)量成正比，具有累加效應(yīng)。Chatterjee等[33]對(duì)8對(duì)人類(lèi)胎兒腸組織進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，RET基因內(nèi)3個(gè)非編碼區(qū)增強(qiáng)子rs2506030、rs7069590 和rs2435357分別結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體β、GATA結(jié)合受體2(GATA binding protein 2，GATA2)和SOX10，“A-T-T”“G-T-T”單體型對(duì)應(yīng)的RET基因表達(dá)最低，同時(shí)，GDNF、GFRα1表達(dá)增高，卡西塔斯B系淋巴瘤原癌基因、SOX10、GATA2表達(dá)降低，視黃酸受體β表達(dá)不變。不同的增強(qiáng)子基因型組合可不同程度地影響RET基因的表達(dá)水平以及部分RET以外的基因，說(shuō)明這些效應(yīng)可能還通過(guò)其他順式作用調(diào)控元件和增強(qiáng)子發(fā)揮作用[33]。

2.4以EDNRB為核心的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) EDNRB是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的另一關(guān)鍵基因(圖1)，Chatterjee和Chakravarti[36]實(shí)驗(yàn)表明，EDNRB基因的轉(zhuǎn)錄因子至少包括GATA2、SOX10和NK2同源框5三種，可分別結(jié)合EDNRB基因的3個(gè)增強(qiáng)子：E9(chr13:78481415-78482733)、E10(chr13:78493407-78494720)和E7(chr13:78439541-78440595)。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Ednrb、Gata2、Sox10可正向調(diào)控Ednrb的表達(dá)；人類(lèi)樣本檢測(cè)結(jié)果證實(shí)EDNRB表達(dá)下降到一定程度時(shí)會(huì)降低SOX10、GATA2的表達(dá)水平；其中，關(guān)鍵基因?qū)D(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化更加敏感。轉(zhuǎn)錄因子SOX10和GATA2是EDNRB和RET基因的共有轉(zhuǎn)錄因子，EDNRB與RET的表達(dá)也可互相影響。在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，基因表達(dá)水平除受順式調(diào)控元件的調(diào)控外，還與多種表觀遺傳學(xué)因素有關(guān)，包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、多梳抑制、ATP依賴(lài)的染色質(zhì)重塑和非編碼RNA等[37-39]，但是目前這方面可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)較少，不能直接證明表觀遺傳學(xué)因素參與先天性巨結(jié)腸的致病機(jī)制。

目前，大量基因均已被證實(shí)與先天性巨結(jié)腸的發(fā)生相關(guān)[40]，但它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的準(zhǔn)確位置及相互調(diào)控關(guān)系尚不清楚。黏著斑蛋白(vinculin，VCL)基因編碼與細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)連接相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白，它與包括踝蛋白、肌動(dòng)蛋白和樁蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后發(fā)揮作用。Lai等[32]觀察到攜帶VCL p.Met209Leu突變的短段型先天性巨結(jié)腸患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表現(xiàn)出遷移異常和向腸神經(jīng)元譜系分化能力受限的現(xiàn)象，提示VCL可能也是神經(jīng)嵴細(xì)胞分化遷移的調(diào)控基因之一。Gui等[40]對(duì)長(zhǎng)段型先天性巨結(jié)腸患者的全外顯子組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，患者攜帶DENN功能域包含基因3、NCLN(nicalin)、NUP98(nucleoporin 98 and 96 precursor)或TBATA(thymus,brain and testes associated)突變。其中，NCLN在結(jié)腸呈特異性高表達(dá)；NUP98編碼核孔復(fù)合體，參與眾多細(xì)胞生理過(guò)程，包括核輸入/輸出、有絲分裂進(jìn)程和基因表達(dá)調(diào)控；TBATA則可能與神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生有關(guān)。排除基因編輯脫靶效應(yīng)后，經(jīng)斑馬魚(yú)嗎啉代基因敲低實(shí)驗(yàn)和CRISPR/Cas9敲除實(shí)驗(yàn)表明，這4個(gè)基因中任何一個(gè)發(fā)生缺陷都會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)腸道遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失。

3 細(xì)胞遷移

3.1磷酸酶和肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子4(phosphatase and actin regulator 4，PHACTR4)基因通過(guò)細(xì)胞自主作用控制細(xì)胞遷移 腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移障礙也可導(dǎo)致人類(lèi)腸道遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，這種遷移障礙可能通過(guò)細(xì)胞自主作用或細(xì)胞非自主作用兩種機(jī)制形成。PHACTR4(MIM：608726)通過(guò)細(xì)胞自主作用影響腸神經(jīng)嵴細(xì)胞在腸道間充質(zhì)中的遷移活動(dòng)，見(jiàn)圖1。Zhang等[41]發(fā)現(xiàn)Phactr4基因功能缺陷會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失；延時(shí)成像顯示胚胎發(fā)育期腸道內(nèi)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞群遷移缺陷；同時(shí)，突變的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞出現(xiàn)隨意的細(xì)胞突起以及定向、連鎖性遷移中斷等現(xiàn)象。Phactr4編碼蛋白與整合素和絲切蛋白在細(xì)胞突起處共定位，通過(guò)Rho/ROCK途徑負(fù)調(diào)控整合素信號(hào)，并通過(guò)協(xié)調(diào)蛋白磷酸酶1與絲切蛋白活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[42]。Zhang等[41]的實(shí)驗(yàn)表明，板狀偽足的形成和體內(nèi)腸神經(jīng)嵴細(xì)胞連鎖性遷移缺陷均可通過(guò)抑制ROCK和整合素的功能獲得特異性挽救。

3.2基因整合素亞基β1和Ⅵ型膠原蛋白α鏈(collagen type Ⅵ alpha chain，COL6A)的產(chǎn)物通過(guò)非細(xì)胞自主作用影響細(xì)胞遷移 細(xì)胞外基質(zhì)成分異常也會(huì)阻礙腸神經(jīng)嵴細(xì)胞在腸道間充質(zhì)內(nèi)的遷移活動(dòng)，這是一種細(xì)胞非自主作用，見(jiàn)圖1。細(xì)胞外基質(zhì)有支架作用，可通過(guò)與分泌型配體或跨膜受體相互作用來(lái)影響包括遷移、增殖、存活和(或)分化在內(nèi)的一系列細(xì)胞行為[17-18]。細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)異常的模式動(dòng)物中腸神經(jīng)嵴細(xì)胞往往不能完成在后腸的定植，其原因包括：①Breau等[43]證明整合素是細(xì)胞外基質(zhì)的主要黏附受體，編碼整合素亞基β1基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)肌腱蛋白C、纖維連接蛋白表達(dá)增加，腸神經(jīng)嵴細(xì)胞對(duì)肌腱蛋白C的抑制作用增強(qiáng)，而對(duì)纖維連接蛋白的刺激作用不敏感；②Akbareian等[44]證明細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白腱鞘蛋白C在腸神經(jīng)嵴細(xì)胞進(jìn)入盲腸后表達(dá)，具有促進(jìn)腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移作用，若表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移受限。

此外，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白Ⅵ的含量也會(huì)影響腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移，見(jiàn)圖1。Soret等[45]發(fā)現(xiàn)先天性巨結(jié)腸小鼠模型“Holstein”的Col6a4基因表達(dá)水平上調(diào)，發(fā)育中和出生后細(xì)胞外基質(zhì)中的總膠原蛋白Ⅵ水平顯著升高，腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移明顯受阻。Heuckeroth[46]指出COL6A1和COL6A2位于人類(lèi)第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂，并在21-三體綜合征胎兒皮膚中過(guò)表達(dá)；可能單獨(dú)與COL6A3相互作用，形成經(jīng)典的α1-α2-α3三聚體膠原蛋白單體。Nishida等[47]利用小鼠實(shí)驗(yàn)表明，膠原蛋白Ⅵ可抑制纖維連接蛋白誘導(dǎo)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、擴(kuò)散，形成擴(kuò)散形態(tài)較窄、應(yīng)力纖維形成較弱的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞；在含有人Ⅵ型膠原蛋白的培養(yǎng)板上培養(yǎng)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞中，局部黏附復(fù)合體成分p130Cas的表達(dá)水平和磷酸化程度均明顯降低。COL6A1為先天性巨結(jié)腸風(fēng)險(xiǎn)基因，與唐氏綜合征患者的先天性巨結(jié)腸高度易感相關(guān)[45]。

4 環(huán)境因素改變風(fēng)險(xiǎn)等位基因外顯率

先天性巨結(jié)腸是基因與環(huán)境因素共同致病的復(fù)雜人類(lèi)遺傳病，遺傳因素的貢獻(xiàn)度雖大于80%[2]，但環(huán)境因素也是不可忽視的重要病因之一，見(jiàn)圖1。Lake等[48]證明了麥考酚酯作為環(huán)境因素導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸的假設(shè)。麥考酚酯是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的生物合成抑制劑，可損害斑馬魚(yú)腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，還可選擇性地?fù)p害小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞的增殖、延遲其遷移并最終誘發(fā)腸道無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的癥狀。體外實(shí)驗(yàn)中，麥考酚酯的處理也可明顯抑制腸神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞的生存和增殖，并縮短細(xì)胞遷移距離。有研究對(duì)嘌呤回收基因次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的X-失活處理嵌合體的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麥考酚酯通過(guò)減少腸神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞增殖的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞遷移缺陷和無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的類(lèi)似癥狀[48]。研究顯示，一些臨床上重要的抗代謝應(yīng)激類(lèi)藥物(如葉酸)、維生素B12缺乏、抗葉酸類(lèi)藥物(如甲氧芐啶和甲氨蝶呤)和其他抗代謝物(如硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤)均可增加先天性巨結(jié)腸的易感性[48-49]，提示環(huán)境因素可能通過(guò)增加某些遺傳變異的外顯率加重先天性巨結(jié)腸的病理表型。

5 小 結(jié)

現(xiàn)已明確先天性巨結(jié)腸的發(fā)生與腸神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖、分化、遷移異常密切相關(guān)，異常的原因包括：①環(huán)境因素與遺傳和表觀遺傳學(xué)因素；②細(xì)胞自主性作用與細(xì)胞非自主性作用；③基因編碼區(qū)罕見(jiàn)突變，包括功能獲得性突變或功能喪失性突變(單倍劑量不足、顯性負(fù)效應(yīng)等)與基因非編碼區(qū)順式調(diào)控元件變異所致的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能異常。目前，約72%的先天性巨結(jié)腸患者能檢測(cè)到較為明確的遺傳學(xué)易感因素，另外仍有28%的患者發(fā)病原因尚不明確[2]。未來(lái)，應(yīng)更加關(guān)注基因組內(nèi)非編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其所在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多種風(fēng)險(xiǎn)等位基因的累加效應(yīng)對(duì)先天性巨結(jié)腸發(fā)生所起的作用[50]，以深入地理解該病的發(fā)病機(jī)制。