基于正交試驗法優(yōu)選制何首烏提取工藝

關(guān)鍵詞：正交試驗;二苯乙烯苷;游離蒽醌;提取工藝

何首烏為蓼科植物何首烏（PolygonummultiflorumThunb）的干燥塊根，制何首烏為何首烏的炮制加工品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁脂的作用[1]。制何首烏作為傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中藥，在臨床應(yīng)用廣泛?！吨袊幍洹?020版一部更是收錄了包括人參首烏膠囊、乙肝養(yǎng)陰活血顆粒等多種包含制何首烏的中成藥?，F(xiàn)代研究表明，何首烏中二苯乙烯苷、蒽醌類具有保護(hù)神經(jīng)、改善記憶、保肝、消炎、抗菌等作用[2]。目前對何首烏的研究多集中在藥材采收期、產(chǎn)地及飲片的炮制、質(zhì)量變準(zhǔn)、藥理活性等方面，鮮有對其提取工藝的研究[3]。本研究以二苯乙烯苷、游離蒽醌為指標(biāo)，通過考察提取溶劑、提取方法，確定制何首烏的最佳提取工藝，以期為制何首烏的開發(fā)提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下：

1儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（waters 2996檢測器），Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），AY220型電子天平（精確度為萬分之一），sartotius.BP211D型電子天平（精確度為十萬分之一），Anke TGL-16B離心機(jī)，南京金正教學(xué)儀器有限公司RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，江蘇國勝實驗儀器廠HH-S恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

大黃素甲醚、大黃素、二苯乙烯苷，購自瑞芬思生物技術(shù)有限公司（批號：D-004-130315、D-029-130401、F-022-130512）。制何首烏飲片由貴州昌昊有限公司提供，產(chǎn)地貴州省從江縣，經(jīng)吳啟南鑒定鑒定為蓼科植物何首烏Polygonummultiflorum Thunb的炮制品。甲醇與乙腈均為色譜純，水為超純水（實驗室自制），乙醇（分析純）。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與對照品的制備

色譜條件：固定相為Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），二苯乙烯苷：以乙腈-水（25∶75）為流動相;檢測波長為320 nm。游離蒽醌：以甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）為流動相;檢測波長為254 nm[1]。柱溫均為25℃，流速：1 ml/min。

對照品溶液的制備：取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1ml含0.199 mg的溶液，即得。取大黃素對照品、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成大黃素3.98 mg/100 ml、大黃素甲醚2.18 mg/100ml的溶液。

依照上述色譜條件，按照要求對對照品進(jìn)行稀釋，各進(jìn)樣10 μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的回歸方程分別為Y=2.9×107X-97302，r=0.9998;Y=3.2×107X-13422，r=0.9999;Y=2.9×107X-4541.3，r=0.9999。

2.2 制首烏提取溶劑優(yōu)選

2.2.1 樣品的制備

取制何首烏飲片粗粉約8 g，分別加10倍量95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水浸泡0.5 h，加熱回流3次，每次回流1.5 h，濾過，合并濾液，95%乙醇定容到500 ml，分別取200 ml減壓回收乙醇并濃縮。濃縮液置蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，得到2份樣品。

2.2.2 樣品的測定

分別取不同提取方式得到的樣品，一份置100 ml容量瓶中，取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于測定二苯乙烯苷含量。取另一份置100 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作為供試品溶液，測定游離蒽醌[3]。依照色譜條件，分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄各指標(biāo)成分的含量。結(jié)果見表1。

2.3 制何首烏提取工藝優(yōu)選

根據(jù)提取溶劑優(yōu)選結(jié)果及前期實驗結(jié)果，通過正交試驗法，考察溶劑量、提取次數(shù)、乙醇濃度3個因素對制何首烏提取的影響，從而確定最佳的提取工藝。

2.3.1 樣品的制備

取制首烏4 g，用所選溶劑浸泡0.5 h，按正交試驗設(shè)計方案進(jìn)行試驗，依照制首烏提取溶劑優(yōu)選中制備方法進(jìn)行制備，最后得到2份樣品。

2.3.2 樣品溶液制備

取樣品，一份置50 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容。取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于測定二苯乙烯苷含量。取另一份置50 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作為供試品溶液。

2.3.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，運用回歸方程計算含量。

2.3.4 正交試驗及結(jié)果

分別取4 g制何首烏粉末，根據(jù)2.3.1的步驟，對樣品進(jìn)行處理，進(jìn)行9組試驗，實驗結(jié)果及方差分析見表2～3。

由表2直觀分析可知：KA3>KA2>KA1，KB3>KB2>KB1，KC2>KC3>KC1，極差結(jié)果顯示因素影響性為B>C>A，故A3B3C2組合提取效果較好，即用10倍量60%乙醇回流3次。

由表3方差分析可知3個因素均無顯著性差異。綜合以上結(jié)果，在實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合實際的生產(chǎn)情況，確定A2B3C2為最終工藝，即用10倍量60%乙醇回流3次。在保證療效的同時，降低生產(chǎn)成本。

2.4 工藝驗證

稱取4 g制首烏按照A2B3C2組合工藝條件進(jìn)行加熱回流，每組試驗樣品平行3份，依法測定。結(jié)果見表4。

工藝驗證結(jié)果表明：A2B3C2組合中二苯乙烯苷、游離蒽醌的含量與正交工藝中的含量相當(dāng)，差異較小。且A2B3C2組合工藝的RSD較小，工藝較為穩(wěn)定。同時縮短生產(chǎn)周期，大大提高了經(jīng)濟(jì)效益，因此加熱回流最佳工藝為10倍量60%乙醇回流3次。

3討論

本實驗首先通過HPLC法，以二苯乙烯苷、游離蒽醌為指標(biāo)考察了不同提取溶劑對制何首烏的提取效果。通過查閱文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，提取溶劑、提取次數(shù)、溶劑量對飲片提取效果影響較為明顯，故本研究選取上述3個因素，優(yōu)選制何首烏的提取工藝。通過預(yù)實驗，分別確定了3個因素的水平。

本實驗采用加權(quán)綜合評分法，對實驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分。文獻(xiàn)研究表明，何首烏中主要的活性成分為二苯乙烯苷、蒽醌類化合物，其中二苯乙烯苷更是表現(xiàn)出多種生物活性，與制何首烏的補(bǔ)益作用更為相符[8]。

實驗結(jié)果顯示，二苯乙烯苷在60%乙醇條件下提取率較高，蒽醌在70%乙醇中提取率較高，提取結(jié)果與化學(xué)成分性質(zhì)相符合A因素K3>K2>K1，其余兩個因素K2最大，結(jié)果表明因素水平設(shè)計的合理性;極差結(jié)果顯示提取次數(shù)對提取效果的影響最大，乙醇濃度次之，其與方差分析結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：184.

[2]李帥鋒，鄭傳柱，張麗，等.不同產(chǎn)地何首烏藥材的質(zhì)量分析[J].江蘇中醫(yī)藥，2015，47（8）：69-71.

[3]楊建波，高慧宇，王雪婷，等.何首烏中1個新的木脂素酰胺類化合物[J].中草藥，2021，52（18）：5475-5482.