UPLC-MS/MS法檢測當歸養(yǎng)血丸中的阿膠

鄭文燕 李哲 蔡燕娟 許潤娟

中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山528400

當歸養(yǎng)血丸為益氣養(yǎng)血調經類中藥復方制劑，收載于《中國藥典》（2015年版）一部［1］，處方由當歸、白芍、地黃、炙黃芪、阿膠、牡丹皮、香附、茯苓、杜仲、白術組成，阿膠在處方中投料量約為7%。近年來，隨著膠類藥材用量增長，巨大的利益驅動和尖銳的供需矛盾導致膠類藥材的生產環(huán)境亂象叢生，市場上含膠類的制劑存在不投、少投、摻偽投料的現(xiàn)象［2-3］。針對膠類藥材造假問題，中國食品藥品檢定研究院開展了一系列的研究工作，建立了阿膠、龜甲膠、鹿角膠3種膠類藥材專屬性特征肽的鑒別方法［1］以及其補充檢驗方法［4-6］，以期提高膠類藥材的質量控制水平?！吨袊幍洹罚?015年版）收載的含膠類藥材的成方制劑共44個，僅有兩個制劑品種（阿膠三寶膏、復方阿膠漿）的現(xiàn)行標準中，收載了專屬性強的膠類藥材特征肽的檢測方法［7］，大多數(shù)缺乏針對制劑中膠類藥材的專屬性質量控制項目，使得含膠類藥材的中成藥摻偽造假投料的現(xiàn)象存在很大空間。

目前，當歸養(yǎng)血丸中專屬性強的阿膠藥材鑒別方法尚無文獻報道，現(xiàn)行標準也無針對動物藥材阿膠的質控方法，這使得該制劑的售價差異很大，質量難以保證，也給患者的用藥安全帶來隱患。近年來，關于膠類制劑中阿膠藥材的專屬性檢測方法研究報道較多［8-11］，本文采用UPLC-MS/MS技術，建立當歸養(yǎng)血丸中阿膠專屬性特征肽的鑒別方法，以期保障該制劑的安全有效。

1 儀器與材料

Agilent 1290～6460 Triple Quad超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；AB SCIEX 3200 Q-Trap超快速高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國AB公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水器（德國Merck Millipore公司）；SB-300 DTY超聲波多頻清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BWS-0510型水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

黃明膠（批號121695-201301）、阿膠（批號121274-201703）、對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院；胰蛋白酶（質譜級，Promega公司）；甲酸、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；當歸養(yǎng)血丸陰性樣品為按照質量標準處方自制的不含阿膠的樣品，實驗所用樣品為本單位在流通環(huán)節(jié)抽樣或通過網絡渠道購得。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1×100mm，1.8μm）柱；流速0.3mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5μL；流動相：乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）進行梯度洗脫；洗脫程序：0～25min 5%～20%A，25～40min 20%～50%A。

2.2 質譜條件離子化方式：ESI+離子源，掃描模式MRM，霧化器壓力為45psi，干燥氣流量為5L/min，干燥氣溫度為325℃，毛細管電壓為3500V，鞘氣溫度為350℃；檢測離子對：阿膠特征分子離子峰m/z539.8（雙電荷）→923.8，612.4作為檢測離子對［1］。

2.3 供試品溶液的制備取當歸養(yǎng)血丸適量，研碎，精密稱取處理好的樣品1.50g，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶散，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，離心（轉速為3500r/min）5min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12h，即得。

胰蛋白溶液（臨用時配制）：取胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1μL中含1μg的溶液。

2.4 對照藥材溶液的制備取對照藥材粉末（約0.10g）適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶解，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12h，即得。

2.5 專屬性試驗用不含阿膠的樣品和黃明膠作為陰性樣品，選擇阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為檢測離子對進行測定，結果陰性樣品色譜圖中，與對照藥材（阿膠）溶液相應的位置上，無相應的色譜峰，認為當歸養(yǎng)血丸陰性樣品以及其他膠類如黃明膠對當歸養(yǎng)血丸樣品測定無干擾，方法專屬性良好。見圖1。

2.6 檢測下限測定取阿膠對照藥材粉末（約0.10g）適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶解，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻。取該溶液適量，并平行稱取4份當歸養(yǎng)血丸陰性樣品（1.50g），照“2.3供試品溶液的制備”方法分別制得含阿膠為0.2%、0.5%、1%、5%的當歸養(yǎng)血丸系列溶液，以阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為檢測離子對進行測定，結果含阿膠為0.2%的當歸養(yǎng)血丸溶液中，阿膠特征分子離子峰的信噪比約為3∶1，因此檢測下限為含阿膠為0.2%的當歸養(yǎng)血丸樣品溶液，在MRM模式下檢測。

圖1 當歸養(yǎng)血丸（A）、阿膠對照藥材（B）、陰性樣品（C）、黃明膠對照藥材（D）的EIC色譜圖a m/z 539.8（雙電荷）→612.4 b m/z 539.8（雙電荷）→923.8

2.7 重復性試驗取當歸養(yǎng)血丸樣品（批號：180302），按“2.3供試品溶液的制備”項平行制備6份供試品溶液，測定。結果當歸養(yǎng)血丸供試品溶液中均檢出相應的阿膠特征肽離子峰，以m/z539.8（雙電荷）→923.8，612.4特征分子離子峰峰面積計算，峰面積的RSD分別為4.3%、2.4%，表明方法具有良好的重復性。

2.8 樣品測定以所建立的方法對3個廠家10批次當歸養(yǎng)血丸樣品進行測定，結果均檢出阿膠特征肽，可以作為制劑中阿膠藥材的鑒別方法。

表2 當歸養(yǎng)血丸中阿膠檢測結果

3 討論

3.1 供試品制備方法的考察當歸養(yǎng)血丸為處方中各味藥材粉末投料生產，制劑中煉蜜含量較高，供試品超聲處理后，溶液混濁較黏稠，若直接采用0.22μm微孔濾膜濾過，操作困難。因此供試品超聲處理后采用離心的方式，除去溶液中的沉淀，得到較澄清的上清液后，再濾過，取續(xù)濾液進行酶解。為考察阿膠粉末在溶散過程中是否能夠溶解完全，制備過程中阿膠分別為以粉末及溶液兩種狀態(tài)與當歸養(yǎng)血丸陰性樣品混合，比較阿膠特征分子離子峰的峰面積。結果顯示，阿膠固體樣品和阿膠液體樣品中阿膠特征分子離子峰的色譜峰面積基本一致，表明前處理過程中，阿膠粉末溶解完全。

3.2 酶解時間和酶量的考察參考《中國藥典》（2015年版）阿膠鑒別方法［1］，阿膠的取樣量為0.1g，依據(jù)當歸養(yǎng)血丸處方量及制劑工藝計算，每1.50g丸中約含有0.10g阿膠對照藥材，由此確定供試品的取樣量為1.50g。

參考《中國藥典》（2015年版）阿膠鑒別方法的酶解時間和酶用量［1］以及《中國藥典》（2015年版）四部“通則3405肽圖檢查法”中的溶劑條件［12］，在37℃恒溫水浴中，取1.50g當歸養(yǎng)血丸，酶用量分別為10、15、20μL（酶濃度1mg/mL），酶解8、12、16、20h后分別進樣，計算當歸養(yǎng)血丸中阿膠特征分子離子峰的峰面積。結果表明當歸養(yǎng)血丸取樣量為1.50g，酶用量10μL，酶解時間12h與酶用量20μL，酶解時間20h中阿膠特征分子離子峰的峰面積基本一致。最終確定當歸養(yǎng)血丸取樣量為1.50g，酶用量為10μL，酶解時間為12h。

3.3 耐用性考察考察了本方法在Agilent 1290-6460 Triple Quad、AB SCIEX 3200 Q-Trap，兩臺高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀上的重現(xiàn)性，以m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為阿膠特征肽離子對進行檢測，結果表明兩個品牌的UPLC-MS/MS均可檢出阿膠特征分子離子峰，方法耐用性良好。

3.4 結論當歸養(yǎng)血丸現(xiàn)行質量標準中缺乏專屬性強的阿膠鑒別方法，阻礙了該類制劑的質量控制和市場監(jiān)管。本文所建立的當歸養(yǎng)血丸中阿膠的定性鑒別方法專屬性強、準確可靠、重現(xiàn)性好，可以對制劑中阿膠藥材進行有效監(jiān)控，為該類制劑的療效及服用安全提供保障，具有重要的社會應用價值。