白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖和凋亡的作用研究

陳龍，陳裕鳳，張淼，李永燕，沈運(yùn)連，許立拔

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種以胃為原發(fā)部位的上皮源性惡性腫瘤，胃癌細(xì)胞惡性增殖和侵襲能力強(qiáng)，預(yù)后差，5年生存率較低［1-2］。目前，胃癌的主要治療手段是手術(shù)切除聯(lián)合化療，常用的化療藥物有5-氟脲嘧啶、阿帕替尼、奧沙利鉑、表阿霉素和多西他賽等，化療藥物有一定療效，但副作用大，對(duì)患者身體傷害較大，在臨床長(zhǎng)期使用受限［3］。中醫(yī)藥作用緩和，常用于改善手術(shù)后并發(fā)癥，減輕放、化療的不良反應(yīng)，從而提高患者的體質(zhì)和生活質(zhì)量。因此，利用中醫(yī)藥理論指導(dǎo)篩選天然產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)并開(kāi)發(fā)出低毒高效的抗胃癌新藥意義重大。

白花蛇舌草［Hedyotis diffusaWilld.或Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.］屬于茜草科耳草屬植物，有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛的功效［4］，對(duì)大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等均有抑制作用［5-9］。內(nèi)生真菌與宿主植物共生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物豐富，很多內(nèi)生真菌與宿主植物的活性成分和功效相似，同時(shí)內(nèi)生真菌還有抑制有害細(xì)菌、分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有助宿主生長(zhǎng)的作用［10-11］。研究表明，多種內(nèi)生真菌和宿主一樣具有抗腫瘤活性，如莪術(shù)內(nèi)生真菌和宿主一樣具有抗肝癌和胃癌活性；同時(shí)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物如黃酮類化合物，也具有明顯的腫瘤抑制作用［12-14］。有研究表明，白花蛇舌草及其黃酮類化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡［15-17］。目前，白花蛇舌草內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)胃癌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法測(cè)定白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同提取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡變化，探討白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1治療胃癌的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株及腫瘤細(xì)胞株白花蛇舌草采集于廣西壯族自治區(qū)南寧市青秀區(qū)，經(jīng)鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld）；白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1菌株（BY1）由廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離提供；人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)8118276）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)1951208）為賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司產(chǎn)品；胎牛血清（批號(hào)18060505）為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)413Y053）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS液，批號(hào)20181226）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)821D038）、青鏈霉素混合液（批號(hào)20180927）和5-氟脲嘧啶（5-FU，批號(hào)1015D021）均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；石油醚（批號(hào)20181024）、乙酸乙酯（批號(hào)20170103）、氯仿（批號(hào)20180305）和甲醇（批號(hào)20170613）均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙醇消毒液（批號(hào)20181030）為廣西博亨醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S電子天平（感量：0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Epoch2酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；ZW-A微量震蕩器（常州榮華儀器制造有限公司）；C170二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER公司）；CKX53倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；VORTFX-5漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；BSC-1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 BY1不同部位提取液的制備取干燥BY1菌絲適量，剪碎，置于三角燒瓶中，加入10倍量石油醚，40 kHz超聲提取30 min，過(guò)濾，共3次。合并3次濾液，減壓濃縮（溫度不超過(guò)60℃）揮干溶劑，所得菌絲體按先后順序分別加入10倍量的乙酸乙酯、氯仿、甲醇超聲提取3次，合并濾液減壓濃縮至稠膏，分別得乙酸乙酯部位（1 g相當(dāng)于106.38 g菌絲）、氯仿部位（1 g相當(dāng)于200 g菌絲）和甲醇部位（1 g相當(dāng)于84.74 g菌絲）稠膏，置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?。取無(wú)菌BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位在超凈工作臺(tái)內(nèi)，使用旋渦混勻器，加入含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，旋渦混勻稀釋成相應(yīng)濃度的含培養(yǎng)基藥液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人胃癌細(xì)胞SGC-7901接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)環(huán)境為二氧化碳培養(yǎng)箱，設(shè)置37℃、5%CO2、飽和濕度，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青鏈霉素（含青霉素80 U/ml和鏈霉素0.08μg/ml）的1640完全培養(yǎng)液，2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。

2.3 同濃度下BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖抑制率的影響取BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位稠膏，加入含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，調(diào)配終濃度均為250μg/ml，另設(shè)空白組和5-氟脲嘧啶組（25μg/ml）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞SGC-7901，調(diào)節(jié)密度至5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液。在96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液（約5 000個(gè)/孔）。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，在相應(yīng)孔中加入200μl相同濃度含完全培養(yǎng)基的藥液，每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入20μl MTT溶液（5 mg/ml）繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10 min使溶出物充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，分別計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率（%）=（空白組OD值-給藥組OD值）/空白組OD值×100%。

2.4 BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901半數(shù)抑制濃度（IC50）的影響參照文獻(xiàn)［18］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位設(shè)置5個(gè)濃度，分別為1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml，72μg/ml和30μg/ml；氯仿部位設(shè)置5個(gè)濃度，分別為500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml，61μg/ml和30μg/ml；甲醇部位設(shè)置5個(gè)濃度，分別為1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml，121μg/ml和60μg/ml；另設(shè)空白組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞SGC-7901，調(diào)節(jié)密度至5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，在相應(yīng)孔中加入200μl不同濃度含完全培養(yǎng)基的藥液，每個(gè)樣品濃度重復(fù)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，分別于每孔加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10 min使溶出物充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，分別計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及各樣品半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.5 BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞核凋亡形態(tài)的影響參考文獻(xiàn)［19］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位設(shè)置4個(gè)濃度，分別為1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml和72μg/ml；氯仿部位設(shè)置4個(gè)濃度，分別為500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml和61μg/ml；甲醇部位設(shè)置4個(gè)濃度，分別為1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml和121μg/ml；另設(shè)5-氟脲嘧啶組（10μg/ml）和空白組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞SGC-7901調(diào)整至1×106個(gè)/ml，接種至6孔板（內(nèi)置無(wú)菌蓋玻片），每孔1 ml，約1×106個(gè)/孔，觀察細(xì)胞增長(zhǎng)至約80%時(shí)，吸棄原培養(yǎng)液，按設(shè)計(jì)加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，每孔1 ml。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，吸棄原培養(yǎng)液，用PBS液2 ml清洗3次，再用10%中性福爾馬林液0.5 ml固定15 min后吸棄培養(yǎng)液。用PBS液2 ml清洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml，室溫避光染色20 min，用PBS液2 ml清洗3次，取出蓋玻片，晾干，用抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)并拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA分析，兩組間采用LSD test分析；非正態(tài)和/或方差不齊的數(shù)據(jù)，多組數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H分析，兩組間采用Mann-Whitney U分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 同濃度下BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響見(jiàn)表1。

表1 同濃度下白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響（x±s，n=6）

表1 顯示，與空白組比較，BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位和5-氟脲嘧啶對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901均有顯著抑制作用（P＜0.01），細(xì)胞增殖抑制率分別為55.38%、58.69%、24.92%、65.03%。

3.2 BY1不同提取部位不同濃度對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響見(jiàn)表2～表4、圖1～圖3。

表1 ～表3、圖1～圖3顯示，BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901均有明顯的細(xì)胞毒性作用，濃度-增殖抑制率曲線呈S型，符合Logistic曲線特征；與空白組比較，BY1不同提取部位各濃度OD值或增殖抑制率差異均具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01），BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的IC50值 分 別 為380.53±40.07μg/ml、177.37±11.53μg/ml和1 077.80±40.17μg/ml。

3.3 BY1不同提取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞核凋亡形態(tài)的影響見(jiàn)圖4～圖6。

在熒光顯微鏡下，空白組人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞核熒光反應(yīng)較弱，細(xì)胞凋亡數(shù)目較少，形態(tài)規(guī)則；BY1不同部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901均有明顯的促進(jìn)凋亡作用，細(xì)胞核形態(tài)隨著藥物濃度增大而發(fā)生核固縮聚集，細(xì)胞核不規(guī)則樣變，濃度越大，細(xì)胞核畸形數(shù)目增加；且細(xì)胞核熒光反應(yīng)隨藥物濃度呈正相關(guān)，濃度越大，熒光反應(yīng)加強(qiáng)，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，其中氯仿部位促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡作用最為顯著。

表2 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同濃度乙酸乙酯部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響（x±s，n=6）

圖1 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1乙酸乙酯部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖抑制曲線

表3 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同濃度氯仿部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響 （x±s，n=6）

圖2 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1氯仿部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖抑制曲線

表4 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同濃度甲醇部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響 （x±s，n=6）

圖3 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1甲醇部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖抑制曲線

圖4 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1乙酸乙酯部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

圖5 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1氯仿部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

圖6 白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1甲醇部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

4 討論

胃癌是常見(jiàn)的消化道癌癥之一，胃內(nèi)炎性環(huán)境是促進(jìn)胃細(xì)胞癌變和生長(zhǎng)的主要因素，已有研究表明，炎癥環(huán)境可促進(jìn)多種癌癥形成和發(fā)展［20］。胃癌的發(fā)生發(fā)展與胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡密切相關(guān)，胃細(xì)胞DNA復(fù)制的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，可刺激胃細(xì)胞癌變，故治療胃癌，應(yīng)抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其程序性死亡。胃癌易轉(zhuǎn)移，存活率低于其他腫瘤，一般發(fā)現(xiàn)已是中晚期，無(wú)法根治，只能進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的放療、化療，但副作用大，嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體，降低了患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥在防治胃癌方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，主要是通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的［21］。

本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法觀察白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同提取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用。研究結(jié)果表明，白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1不同提取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞呈濃度依賴性抑制，由強(qiáng)到弱依次為氯仿部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位，并可有效促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為癌細(xì)胞形態(tài)的改變，如核固縮、核碎片和聚集等，促凋亡作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

白花蛇舌草內(nèi)生真菌BY1對(duì)胃癌細(xì)胞具有良好的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，提示其可用于胃癌的防治，其作用機(jī)制可能與內(nèi)生菌的抑菌、抗炎和改變胃內(nèi)炎癥內(nèi)環(huán)境有關(guān)；也可能與內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物有免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，減少淋巴管和血管生成，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。