痰瘀同治法對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠易損斑塊的影響

靳宏光 朱星 李鐵 王義強(qiáng) 成光宇

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2針灸推拿研究所)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種常見(jiàn)慢性進(jìn)行性全身性疾病，往往同時(shí)累及多處血管，嚴(yán)重影響人類健康，其病變的嚴(yán)重程度，主要取決于斑塊的穩(wěn)定性。目前認(rèn)為，在AS過(guò)程中，斑塊的易損性與炎性水平關(guān)系密切，且炎癥反應(yīng)是斑塊易損過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)力，貫穿AS始終〔1〕。本實(shí)驗(yàn)從炎性因子角度觀察具有痰瘀同治作用的參紅通絡(luò)方對(duì)AS大鼠主動(dòng)脈易損斑塊的影響，以期揭示該中藥復(fù)方治療AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體重(280±20)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)SCXK(吉)2011-0004。飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)室，分籠飼養(yǎng)，大鼠自由飲水。飼養(yǎng)室溫度控制在18～22℃，濕度控制在50%～70%，通風(fēng)良好。基礎(chǔ)飼料由20%面粉，3%米粉，25%玉米，25%麩皮，20%豆料，3%骨粉，4%魚粉配制組成。高脂飼料由77%的基礎(chǔ)飼料加入3%膽固醇，10%蛋黃粉，10%豬油構(gòu)成。制備時(shí)先將基礎(chǔ)飼料與膽固醇、蛋黃粉、豬油充分混合攪拌均勻后，加入適量開(kāi)水制成模餅，用微波爐烤干。基礎(chǔ)飼料、膽固醇、蛋黃粉、豬油均由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2藥物、試劑、材料和儀器 中藥方：參紅通絡(luò)方(主要由人參，紅景天，丹參，水蛭，栝蔞，石菖蒲等藥物組成)農(nóng)本顆粒(吉林省萊沃藥業(yè)有限公司)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130068，規(guī)格20 mg/片)；低分子肝素鈉(吉派林，杭州九源基因工程有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H19990035，規(guī)格0.3 ml/瓶)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657，規(guī)格80萬(wàn)U/瓶)。血脂四項(xiàng)〔總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〕試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20171111)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒：sCD40L(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)208180418)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1(美國(guó)Cell Sciences 公司，批號(hào)20161018)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)569180418)、白細(xì)胞介素(IL)-1β(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)370180611)，ACS-H1電子天平、電子計(jì)重秤AWH(SI)、4K15低溫高速離心機(jī)、小型臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、AB×51型OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、Olympus PM-10AO全自動(dòng)顯微照相裝置、HH·W21·600電熱恒溫水浴箱、LKB～V型超薄切片機(jī)、病理攤烤片機(jī)、JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.3方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、辛伐他汀組，每組各16只。球囊損傷術(shù)：除假手術(shù)組只結(jié)扎頸外動(dòng)脈，不行球囊損傷術(shù)，其余各組大鼠均用球囊損傷主動(dòng)脈。所有大鼠麻醉后，仰臥固定，頸部備皮，取頸部正中偏左3 mm切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)2.5～3.5 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉。在左側(cè)頸總動(dòng)脈，下穿兩根4號(hào)絲線，結(jié)扎遠(yuǎn)端，另一根線放置近端備用。在靠近血管遠(yuǎn)端結(jié)扎處，剪開(kāi)一“V” 形小口。假手術(shù)組直接在小口近心端結(jié)扎，其余各組大鼠用準(zhǔn)備好的球囊沿小口處插入頸外動(dòng)脈，繼續(xù)順著血管往下插，經(jīng)過(guò)頸總動(dòng)脈到達(dá)主動(dòng)脈，調(diào)節(jié)壓力泵以6～8ATM擴(kuò)張球囊，放松絲線，恢復(fù)血液供應(yīng)，重復(fù)來(lái)回緩慢抽動(dòng)球囊3次后，撤出球囊，靠近頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，抽去頸總動(dòng)脈處絲線，恢復(fù)動(dòng)脈血流，同時(shí)查看頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈是否充盈搏動(dòng)良好。各組大鼠均用碘伏清洗組織，再用生理鹽水沖洗3遍，逐層縫合。術(shù)后 3 d預(yù)防性應(yīng)用青霉素 20萬(wàn)U皮下注射，低分子肝素鈣繼續(xù)抗凝 3 d。術(shù)后普通飼料飲食，自由飲水1 w。術(shù)后第2周，除假手術(shù)組仍給普通飼料外，其余各組均予以高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飲食飼喂6 w后開(kāi)始采用相應(yīng)藥物灌胃。中藥低劑量組、中藥高劑量組分別予以痰瘀同治中藥參紅通絡(luò)方生藥量7.15 g/(kg·d)、28.60 g/(kg·d)灌胃；辛伐他汀組以辛伐他汀1 mg/(kg·d) 灌胃；假手術(shù)組、AS模型組予以等容積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8 w。觀察指標(biāo)與測(cè)定方法：①一般狀態(tài)觀察：包括動(dòng)物精神狀態(tài)、毛色、飲食量、尿量、體重、死亡等情況。②血清樣品制備：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)眼球摘除取血，所取血液室溫放置30 min至2 h，待其血清析出后，離心制備血清，-20℃冰箱貯存待測(cè)。③標(biāo)本測(cè)定：酶法測(cè)定血清中TC、TG的含量，選擇性沉淀法檢測(cè)LDL-C，HDL-C的含量，ELISA法測(cè)定血清中sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的含量。取大鼠主動(dòng)脈常規(guī)石蠟包埋，切片后做蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 各組大鼠體重均明顯增加，其中以模型對(duì)照組最為明顯。假手術(shù)組、中藥高劑量組大鼠性情較溫順，精神狀態(tài)好，毛色光澤，體態(tài)勻稱，進(jìn)食水及排尿便正常。模型對(duì)照組、中藥低劑量組、辛伐他汀組大鼠性情較暴躁，易撕咬，體態(tài)肥胖，多數(shù)大鼠精神不同程度萎靡，運(yùn)動(dòng)有所減少，皮毛蓬松而無(wú)光澤，其中又以模型對(duì)照組更為突出，排便相當(dāng)。

2.2對(duì)AS大鼠血脂的影響 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組血清TC、TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，中藥高劑量組、中藥低劑量組與辛伐他汀組TC、TG、LDL-C含量均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，中藥高劑量組HDL-C含量顯著升高(P<0.05)，中藥高劑量組在降低TC、LDL-C，升高HDL-C方面與辛伐他汀組相當(dāng)(P>0.05)，但在降低TG方面明顯優(yōu)于辛伐他汀組(P<0.05)，中藥低劑量組在改善TC、LDL-C水平方面明顯優(yōu)于辛伐他汀組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血脂水平比較

2.3對(duì)AS大鼠血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β的影響 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組動(dòng)物血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(均P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，中藥高劑量組、中藥低劑量組與辛伐他汀組sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，且中藥高劑量組與辛伐他汀組相當(dāng)(P>0.05)，中藥低劑量組sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β含量均顯著高于辛伐他汀組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4主動(dòng)脈病理情況 假手術(shù)組內(nèi)膜光滑，平滑肌細(xì)胞排列整齊，模型對(duì)照組大鼠內(nèi)膜欠光滑，平滑肌排列紊亂、增生，伴有大量泡沫細(xì)胞的蓄積，而經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，內(nèi)膜相對(duì)光滑，平滑肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整，少量泡沫細(xì)胞的蓄積和平滑肌增生改善，其中，中藥高劑量組及辛伐他汀組顯著優(yōu)于中藥低劑量組。見(jiàn)圖1。

表2 各組血清sCD40L、ICAM-1、TNF-α、IL-1β水平比較

圖1 各組主動(dòng)脈病理觀察(HE，×200)

3 討 論

AS發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但損傷-炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)目前被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可〔2〕，炎癥已成為AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的核心因素。易損斑塊的形成即是一個(gè)損傷與抗損傷、炎癥激活與機(jī)體防御的慢性炎癥過(guò)程〔3〕，炎癥反應(yīng)貫穿于AS斑塊形成、發(fā)展和破裂的全過(guò)程。研究表明，sCD40L可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生如IL、ICAM、TNF等多種與AS斑塊形成相關(guān)的炎癥因子，從而加速斑塊的形成，當(dāng)其表達(dá)水平越高時(shí)，其斑塊形成速度越快〔4〕，且與斑塊的易損性密切相關(guān)，被認(rèn)為是心血管疾病患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素〔5～7〕。

參紅通絡(luò)方由人參、紅景天、丹參、水蛭、栝蔞、石菖蒲等藥物組成，具有益氣活血、豁痰通絡(luò)作用。前期研究證實(shí)，痰瘀同治法對(duì)血脂異?；颊哐捻?xiàng)均有不同程度改善〔8〕，能降低頸動(dòng)脈粥樣斑塊患者頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)及斑塊 Crouse 積分〔9〕，同時(shí)能提高不穩(wěn)定型心絞痛療效及降低血空腹胰島素(FINS)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平〔10〕。通過(guò)主動(dòng)脈病理觀察顯示，參紅通絡(luò)方能保護(hù)血管內(nèi)膜、減少脂滴沉積和泡沫細(xì)胞形成，具有穩(wěn)定斑塊的作用。綜上，說(shuō)明該復(fù)方制劑有較好的降脂、抑制炎性因子、保護(hù)血管內(nèi)膜的作用，可能是其抗AS、穩(wěn)定易損斑塊的部分機(jī)制。