HAG聯(lián)合地西他濱對(duì)骨髓增生異常綜合征患者免疫功能的影響

劉艷芬 劉欣 訾建杰 馮志剛 閆慧 韓寶艷 張成俠

骨髓增生異常綜合征(MDS)是多見于中老年人群的血液系統(tǒng)常見病，臨床表現(xiàn)主要有貧血、出血、造血功能衰竭等，嚴(yán)重者甚至轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病，病死率較高[1,2]。迄今為止，MDS發(fā)病機(jī)制尚未闡明。大量研究表明，免疫機(jī)制在MDS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3,4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HAG(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+粒細(xì)胞集落刺激因子)聯(lián)合地西他濱治療MDS具有良好的治療效果。本研究探討了HAG聯(lián)合地西他濱對(duì)MDS患者免疫功能的影響，以期為此類疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2014年2月至2015年1月我院收治的MDS患者86例納入研究范圍，隨機(jī)分為HAG組和聯(lián)合組，每組43例。HAG組男24例，女19例；年齡26～71歲，平均(54.3±6.5)歲；分型：難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-2 27例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-1 11例，MDS轉(zhuǎn)化急性髓系白血病4例，慢性-單核細(xì)胞白血病1例；IPSS分組：中危-1 15例，中危-2 22例，高危6例。聯(lián)合組男25例，女18例；年齡25～72歲，平均(53.4±6.0)歲；分型：難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-2 26例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-1 12例，MDS轉(zhuǎn)化急性髓系白血病3例，慢性-單核細(xì)胞白血病2例；IPSS分組：中危-1 13例，中危-2 25例，高危5例。2組性別比、年齡、分型、IPSS分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合MDS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②患者均有全血細(xì)胞減少、造血功能衰竭等典型表現(xiàn)；③患者及家屬簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②肝腎等重要臟器功能障礙者；③精神疾病患者；④入組前6個(gè)月服用過(guò)影響造血功能的藥物者；⑤對(duì)治療藥物過(guò)敏者；⑥妊娠期或哺乳期女性患者。

1.3 治療方法 2組均給予抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持治療。HCG組給予高三尖杉酯堿(辰欣藥業(yè)股份有限公司，1 ml∶1 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20064996)+阿糖胞苷(海正輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054695)+粒細(xì)胞集落刺激因子(協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社，國(guó)藥準(zhǔn)字S200100631)治療。高三尖杉酯堿，1 mg/d，1次/d，溶于250 ml 5%葡萄糖注射液中，靜脈滴注；阿糖胞苷，2 mg/kg，1次/d，靜脈滴注；粒細(xì)胞集落刺激因子，300 μg/d，1次/d，靜脈滴注，連用14 d。聯(lián)合組在HAG組治療基礎(chǔ)上加用地西他濱(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143382)，15 mg/m2，1次/8 h，靜脈滴注,連用3 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.2 Treg/Th17轉(zhuǎn)錄因子:采集骨髓液5 ml，置于肝素抗凝管中，等量PBS稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)。Trizol提取BMMNC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，Real time-PCR法測(cè)定Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)量，設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對(duì)值為2-ΔΔCt。

1.4.3 細(xì)胞因子:采用患者空腹靜脈血，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)。

2 結(jié)果

表1 2組淋巴細(xì)胞亞群表型比較

表2 2組T淋巴細(xì)胞亞群比較

2.3 2組Treg/Th17比較 2組治療前Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg/Th17比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Treg細(xì)胞、Treg/Th17均較治療前顯著降低，Th17細(xì)胞均較治療前顯著升高(P<0.05)，且聯(lián)合組Treg細(xì)胞、Treg/Th17低于HAG組，Th17細(xì)胞高于HAG組(P<0.05)。見表3。

表3 2組Treg/Th17比較

2.4 2組Treg/Th17轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)比較 2組治療前Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Foxp3 mRNA表達(dá)均較治療前顯著降低，RORγt mRNA表達(dá)均較治療前顯著升高(P<0.05)，且聯(lián)合組Foxp3 mRNA表達(dá)低于HAG組，RORγt mRNA表達(dá)高于HAG組(P<0.05)。見表4。

表4 2組Treg/Th17轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)比較

2.5 2組細(xì)胞因子比較 2組治療前IFN-γ、TNF-α比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后IFN-γ、TNF-α均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組IFN-γ、TNF-α低于HAG組(P<0.05)。見表5。

表5 2組細(xì)胞因子比較

3 討論

MDS是一種具有高度異質(zhì)性的難治性血液病，是由于造血干/祖細(xì)胞惡性增殖、分化成熟障礙導(dǎo)致無(wú)效造血、造血功能衰竭，容易發(fā)展為急性白血病，病死率高[6,7]。目前，臨床尚無(wú)治療MDS的特效藥物，化療仍是治療該病的主要方法，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞異?？寺?，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但是多數(shù)化療藥物具有細(xì)胞毒性，治療過(guò)程中也會(huì)殺傷機(jī)體正常細(xì)胞[8]。因此，提高免疫功能是提高化療效果及改善造血功能及預(yù)后的關(guān)鍵。我們前期研究證實(shí)，HAG聯(lián)合地西他濱治療MDS能夠顯著降低骨髓原始細(xì)胞比例，改善患者骨髓造血功能和生活質(zhì)量[9]。

Treg屬于輔助性T淋巴細(xì)胞，其在白血病等腫瘤細(xì)胞表達(dá)增高，通過(guò)抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞及增加免疫耐受降低機(jī)體抗腫瘤能力[13]。Th17是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群成員，通過(guò)分泌IL-17等細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤免疫作用[14]。Foxp3、RORγt是Treg、Th17細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控二者分化、發(fā)育和功能維持方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[15,16]。本研究結(jié)果表明，2組治療前Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg/Th17、Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Treg細(xì)胞、Treg/Th17、Foxp3 mRNA表達(dá)均較治療前顯著降低，Th17細(xì)胞、RORγtmRNA表達(dá)均較治療前顯著升高(P<0.05)，且聯(lián)合組Treg細(xì)胞、Treg/Th17、Foxp3 mRNA表達(dá)低于HAG組，Th17細(xì)胞、RORγt mRNA表達(dá)高于HAG組(P<0.05)。說(shuō)明聯(lián)合組通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)影響Treg/Th17細(xì)胞分化，從而改善細(xì)胞免疫應(yīng)答。

T淋巴細(xì)胞亞群失衡通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)骨髓造血細(xì)胞的分化、成熟，參與MDS發(fā)生發(fā)展。其中IFN-γ、TNF-α是單核巨噬細(xì)胞分泌的造血負(fù)調(diào)控因子，具有促進(jìn)骨髓干/祖細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡的作用，從而導(dǎo)致骨髓病態(tài)造血及全血細(xì)胞減少[17]。本研究結(jié)果表明，2組治療前IFN-γ、TNF-α比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后IFN-γ、TNF-α均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組IFN-γ、TNF-α低于HAG組(P<0.05)。說(shuō)明聯(lián)合組通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分子分泌改善免疫抑制狀態(tài)，從而增強(qiáng)骨髓造血功能。