lncRNA CASC19通過miR-152-3p上調(diào)HMGA2影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

符泰勝 劉春勇

骨肉瘤是一種原發(fā)的骨惡性腫瘤，其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差，靶向治療是可直接靶向特定位點(diǎn)提高腫瘤局部治療效果，同時減少對健康組織的毒性反應(yīng)，部分靶向藥物在骨肉瘤的臨床應(yīng)用中已經(jīng)取得一定療效，尋找開發(fā)更多的靶點(diǎn)和靶向藥物對骨肉瘤的靶向治療具有重要意義[1,2]。研究表明，lncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，可作為一種競爭性的內(nèi)源性RNA與miRNA相互作用，共同參與靶向基因的調(diào)控，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[3]。癌癥易感基因19(cancer susceptibility 19，CASC19)是一種lncRNA，結(jié)直腸癌組織中CASC19高表達(dá)，其與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[4]。CASC19過表達(dá)通過靶向miR-140-5p上調(diào)細(xì)胞遷移誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶1(cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP)增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲，遷移和增殖[5]。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miR-152低表達(dá)，與Enneking分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素[6]。miR-152-3p通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4，TCF4)抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。LINC00174通過使miR-1523-3p海綿化并增加溶質(zhì)載體家族2促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員1(solute carrier family 2/facilitated glucose transporter,member 1，SLC2A1)表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的癌變[8]。研究報道m(xù)iR-490-3p通過靶向高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein AT-hook2，HMGA2)能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。miR-106a-5p上調(diào)可通過靶向骨肉瘤細(xì)胞中的HMGA2抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[10]。然而CASC19對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的應(yīng)收及其機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗旨在研究CASC19是否通過調(diào)控miR-1523-3p/HMGA2影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人成骨細(xì)胞hFOB 1.19和骨肉瘤細(xì)胞Saos2、U2OS、HOS購自美國ATCC；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；載體質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自北京Solarbio公司；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒購自美國Bio-Rad公司；抗體均購于美國Abcam公司；熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體均購自美國Promega公司；Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACSCanto II流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人成骨細(xì)胞hFOB 1.19置于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，骨肉瘤細(xì)胞Saos2、U2OS、HOS置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞Saos2，消化后接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后按照LipofectamineTM2000試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將si-NC、si-CASC19、pcDNA-NC、pcDNA-CASC19、miR-NC、miR-152-3p、anti-miR-NC、anti-miR-152-3p轉(zhuǎn)染至Saos2中，記為si-NC組、si-CASC19組、pcDNA-NC組、pcDNA-CASC19組、miR-NC組、miR-152-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-152-3p組；將si-CASC19分別與anti-miR-NC、anti-miR-152-3p共轉(zhuǎn)染至Saos2中，記為si-CASC19+anti-miR-NC組、si-CASC19+anti-miR-152-3p組；將si-CASC19、anti-miR-152-3p分別與si-NC、si-HMGA2共轉(zhuǎn)染至Saos2中，記為si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC組、si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2組。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2 mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。CASC19和HMGA2以GAPDH為內(nèi)參，miR-152-3p以U6為內(nèi)參，CASC19上游引物序列：5’-GAGGAAGGCAGCACAATGATG-3’，下游引物序列：5’-CTTGCCAGTGTCTTCTCCTGA-3’；HMGA2上游引物序列：5’-CCCAAAGGCAGCAAAAACAA-3’，下游引物序列：5’-GCCTCTTGGCCGTTTTTCTC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-152-3p上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACTG-3’，下游引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取50 μl蛋白樣品于10%的SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達(dá)水平=目的條帶和β-actin條帶的比值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞活性 選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，然后在上機(jī)前5 min再加入5 μl的PI進(jìn)行染色，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每管樣品重復(fù)檢測3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.7 雙熒光素酶報告實(shí)驗驗證 CASC19和miR-152-3p以及miR-152-3p和HMGA2的靶向關(guān)系 構(gòu)建含有miR-152-3p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA CASC19和HMGA2野生型及突變型報告基因載體，將其分別與miR-NC、miR-152-3p通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染至Saos2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 在骨肉瘤細(xì)胞系中，lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2表達(dá)情況 相較于人成骨細(xì)胞hFOB 1.19，骨肉瘤細(xì)胞Saos2、U2OS、HOS中l(wèi)ncRNA CASC19表達(dá)水平升高，miR-152-3p表達(dá)水平下降，HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達(dá)

表1 骨肉瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA CASC19、HMGA2和miR-152-3p表達(dá)量

2.2 低表達(dá)lncRNA CASC19對骨肉瘤細(xì)胞Saos2增殖和凋亡的影響 相較于si-NC組，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞Saos2中l(wèi)ncRNA CASC19表達(dá)水平降低，HMGA2表達(dá)水平降低，CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 低表達(dá)lncRNA CASC19對骨肉瘤細(xì)胞Saos2增殖和凋亡的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測骨肉瘤細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表2 低表達(dá)lncRNA CASC19對骨肉瘤細(xì)胞Saos2增殖和凋亡的影響

2.3 高表達(dá)miR-152-3p對骨肉瘤細(xì)胞Saos2增殖和凋亡的影響 相較于miR-NC組，miR-152-3p組骨肉瘤細(xì)胞Saos2中miR-152-3p表達(dá)水平升高，HMGA2表達(dá)水平降低，CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表3。

表3 高表達(dá)miR-152-3p對骨肉瘤細(xì)胞Saos2增殖和凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

2.4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2 通過Starbase軟件預(yù)測顯示CASC19可直接靶向結(jié)合miR-152-3p，miR-152-3p可直接靶向結(jié)合HMGA2。雙熒光素酶報告基因驗證結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-152-3p和野生型CASC19和HMGA2的載體時，熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-152-3p和靶向突變的CASC19和HMGA2的載體時，miR-152-3p對熒光素酶活性的抑制作用喪失。抑制CASC19表達(dá)后miR-152-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)，過表達(dá)CASC19后miR-152-3p表達(dá)水平下降(P<0.05)；過表達(dá)miR-152-3p，HMGA2表達(dá)水平下降(P<0.05)，抑制miR-152-3p表達(dá)，HMGA2表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表4～7,圖4。

圖4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2;A starbase預(yù)測miR-152-3p和CASC19的靶向關(guān)系；B starbase對HMGA2和miR-152-3p的預(yù)測示意圖；C Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達(dá)

表4 miR-NC或miR-152-3p與CASC19野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Saos2細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-152-3p的表達(dá)

表6 miR-NC或miR-152-3p與HMGA2-3’UTR野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Saos2細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表7 Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達(dá)

2.5 低表達(dá)miR-152-3p可以部分逆轉(zhuǎn)CASC19低表達(dá)對Saos2增殖和凋亡的影響 相較于si-CASC19+anti-miR-NC組，si-CASC19+anti-miR-152-3p組Saos2細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá)水平降低，CyclinD1表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見圖5，表8。

圖5 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表8 敲減miR-152-3p可以部分逆轉(zhuǎn)CASC19低表達(dá)對Saos2增殖和凋亡的影響

2.6 低表達(dá)HMGA2可以逆轉(zhuǎn)因敲減miR-152-3p對CASC19低表達(dá)逆轉(zhuǎn)的影響 與si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC組相比，si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2組HMGA2表達(dá)水平降低，CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6，表9。

表9 低表達(dá)HMGA2可以部分逆轉(zhuǎn)因敲減miR-152-3p對CASC19低表達(dá)逆轉(zhuǎn)的影響

圖6 Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明，lncRNA和miRNA通過相互作用參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。研究報道lncRNA CASC19與晚期胃癌的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，敲低CASC19抑制了體外胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。CASC19在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，高表達(dá)CASC19的患者生存率較差；CASC19通過mi-130b-3p調(diào)節(jié)ZEB2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖，遷移和侵襲[13]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA CASC19高表達(dá)；CASC19低表達(dá)，CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高。說明CASC19低表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且本實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)CASC19靶向負(fù)調(diào)控miR-152-3p。

miRNA主要通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’ UTR)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。研究報道m(xù)iR-152-3p通過抑制Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，KLF4)表達(dá)在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用[15]。miR-152-3p通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8(Cyclin-dependent kinase 8，CDK8)抑制節(jié)肝癌的發(fā)生[16]。lncRNA H19通過靶向miR-152-3p抑制溴結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白4(bromodomain containing protein 4，BRD4)介導(dǎo)的細(xì)胞增殖來抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生[17]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞系中miR-152-3p低表達(dá)，miR-152-3p高表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且CASC19靶向調(diào)控miR-152-3p，miR-152-3p低表達(dá)逆轉(zhuǎn)了CASC19低表達(dá)對Saos2增殖和凋亡的影響。提示，CASC19可能通過調(diào)控miR-152-3p的表達(dá)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡。

已有的研究表明，HMGA2參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]；且研究報道m(xù)iR-98的確通過與HMGA2結(jié)合來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，侵襲，遷移并促進(jìn)其凋亡[18]。實(shí)驗結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞中HMGA2高表達(dá)，表明HMGA2確實(shí)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明lncRNA可通過競爭結(jié)合miRNA,調(diào)控miRNA的靶mRNA[19]。如lncRNA NEAT1通過miR-98-5p調(diào)控HMGA2影響前列腺癌的進(jìn)展[20]。本研究中雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實(shí)了CASC19靶向負(fù)調(diào)控miR-152-3p，而miR-152-3p靶向負(fù)調(diào)控HMGA2。且低表達(dá)HMGA2逆轉(zhuǎn)了因敲減miR-152-3p對CASC19低表達(dá)逆轉(zhuǎn)的影響。以上資料均提示，CASC19可能通過miR-152-3p調(diào)節(jié)HMGA2的表達(dá)而影響骨肉瘤的增殖、凋亡。