LncRNA MFI2-AS1靶向miR-331-3p調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

雷肖蠢 張海良 丁鵬

膿毒癥是臨床常見(jiàn)的一種全身性炎癥疾病之一，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)心臟等多器官功能障礙，但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未闡明[1]。既往研究顯示炎性反應(yīng)與心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡是促使心肌損傷的重要原因[2-4]。研究表明脂多糖(lipopolysacharide，LPS)可與心肌細(xì)胞表面相關(guān)受體結(jié)合而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生從而造成心肌細(xì)胞功能障礙，其可用于建立體外心肌細(xì)胞損傷模型[5]。因而深入探究心肌細(xì)胞損傷機(jī)制有助于改善患者預(yù)后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA MFI2-AS1(Long non-coding RNA MFI2-AS1，LncRNA MFI2-AS1)在LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低MFI2-AS1表達(dá)可抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[6]。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-331-3p(microRNA-331-3p，miR-331-3p)可能是MFI2-AS1的靶基因，研究表明miR-331-3p在胰腺癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮癌基因作用[7]。但MFI2-AS1是否靶向miR-331-3p參與心肌細(xì)胞損傷過(guò)程尚未可知。本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，觀察細(xì)胞中MFI2-AS1與miR-331-3p的表達(dá)水平，分析其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，旨在為揭示心肌損傷的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；LPS購(gòu)自上海睿安生物科技有限公司；Trizol試劑與pcDNA3.1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MFI2-AS1小干擾RNA(si-MFI2-AS1)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、miR-331-3p寡核苷酸模擬物(miR-331-3p mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；miR-331-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-331-3p)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)、RIPA裂解液與二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組:采用含有10% FBS與100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期H9c2細(xì)胞，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細(xì)胞24 h[8]，記作LPS組。將未進(jìn)行處理的H9c2細(xì)胞作為NC組。取對(duì)數(shù)期H9c2細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，分別將si-NC、si-MFI2-AS1、miR-NC、miR-331-3p mimics、si-MFI2-AS1與anti-miR-NC、si-MFI2-AS1與anti-miR-331-3p轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細(xì)胞24 h，分別記作LPS+si-NC組、LPS+si-MFI2-AS1組、LPS+miR-NC組、LPS+miR-331-3p組、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC組、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中MFI2-AS1、miR-331-3p的表達(dá)水平:采用Trizol法提取各組心肌細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。MFI2-AS1正向引物5’-TGAGACGACATCCCTTCCAG-3’，反向引物5’-GGCCCTGAAATGACTTGCTC-3’；miR-331-3p正向引物5’-GATCCCAGATCAAACCAGGC-3’，反向引物5’-GCATGTTCTCCAGATGTCCTTTA-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。MFI2-AS1以β-actin為內(nèi)參，miR-331-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MFI2-AS1、miR-331-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率:收集各組中對(duì)數(shù)期的心肌細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度(5×104個(gè)/ml)，接種于96孔板上(100 μl/孔)，于轉(zhuǎn)染48 h時(shí)向每孔中加入20 μl MTT，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為490 nm處的相對(duì)吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:收集各組對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，加入5 μl PI，混勻，室溫避光孵育10 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MFI2-AS1的靶基因:starbase預(yù)測(cè)顯示MFI2-AS1與miR-331-3p存在靶向關(guān)系，將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型質(zhì)粒WT-MFI2-AS1與突變型質(zhì)粒MUT-MFI2-AS1，分別將WT-MFI2-AS1、MUT-MFI2-AS1與miR-NC、miR-331-3p mimics共轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，分別記作miR-NC組(WT-MFI2-AS1)、miR-331-3p組(WT-MFI2-AS1)、miR-NC組(MUT-MFI2-AS1)、miR-331-3p組(MUT-MFI2-AS1)。各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。同時(shí)分別將si-NC、si-MFI2-AS1、pcDNA-NC、pcDNA-MFI2-AS1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-331-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Cleaved-caspase-3、CyclinD1蛋白表達(dá):收集各組對(duì)數(shù)期H9c2細(xì)胞，加入200 μl RIPA，冰上裂解30 min，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min離心10 min，吸取上清液(總蛋白)。取30 μg 蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，高溫煮沸15 min，蛋白變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Cleaved-caspase-3(稀釋比1∶1 000)、CyclinD1(1∶1 000)、β-actin(稀釋比1∶2 000)一抗稀釋液，洗膜，加入二抗(1∶5 000)，ECL顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 在心肌細(xì)胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表達(dá)情況 與NC組相比，LPS組心肌細(xì)胞中MFI2-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-331-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 在心肌細(xì)胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表達(dá)情況

2.2 低表達(dá)MFI2-AS1對(duì)LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響 與NC組相比，LPS組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-MFI2-AS1組心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 低表達(dá)MFI2-AS1對(duì)LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響

圖1 低表達(dá)MFI2-AS1對(duì)LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測(cè)CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.3 高表達(dá)miR-331-3p對(duì)H9c2的增殖和凋亡的影響 與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-331-3p組心肌細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表3。

表3 高表達(dá)miR-331-3p對(duì)H9c2的增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測(cè)CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.4 LncRNA MFI2-AS1靶向調(diào)控miR-331-3p的表達(dá) starbase預(yù)測(cè)顯示miR-331-3p和MFI2-AS1存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒WT-MFI2-AS1的心肌細(xì)胞中，miR-331-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒MUT-MFI2-AS1的心肌細(xì)胞中，miR-331-3p組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比si-MFI2-AS1組心肌細(xì)胞中miR-331-3p的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pcDNA-NC組相比，pcDNA-MFI2-AS1組心肌細(xì)胞中miR-331-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4、5。

圖3 通過(guò)starbase預(yù)測(cè)miR-331-3p和MFI2-AS1結(jié)合示意圖

表4 miR-NC或miR-331-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

表5 qRT-PCR檢測(cè)miR-331-3p的表達(dá)

2.5 低表達(dá)miR-331-3p可以部分逆轉(zhuǎn)MFI2-AS1低表達(dá)對(duì)H9c2增殖和凋亡的影響 與LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC組相比，LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p組心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表6。

圖4 Western Blot檢測(cè)CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表6 低表達(dá)miR-331-3p可以部分逆轉(zhuǎn)MFI2-AS1低表達(dá)對(duì)H9c2增殖和凋亡的影響

3 討論

LncRNA可通過(guò)調(diào)控下游miRNA的表達(dá)從而參與心肌細(xì)胞凋亡及心肌細(xì)胞損傷過(guò)程[9,10]。但仍有部分LncRNA在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型LncRNA并分析其如何調(diào)控miRNA而發(fā)揮作用。

MFI2-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤與腎細(xì)胞癌等腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[11,12]。但MFI2-AS1在心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)尚未可知。本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中MFI2-AS1的表達(dá)水平明顯升高，提示MFI2-AS1表達(dá)量升高可能促進(jìn)心肌損傷的發(fā)生。研究表明CyclinD1表達(dá)量升高可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，若細(xì)胞接收凋亡信號(hào)時(shí)，細(xì)胞凋亡蛋白可激活caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而促進(jìn)Cleaved-caspase-3表達(dá)量升高最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后可明顯降低心肌細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CyclinD1表達(dá)量降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)量升高。提示LPS可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖從而破壞細(xì)胞增殖/凋亡的平衡狀態(tài)最終造成心肌損傷。本研究進(jìn)一步分析顯示抑制MFI2-AS1表達(dá)后心肌細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞存活率升高，CyclinD1表達(dá)上調(diào)，Cleaved-caspase-3表達(dá)下調(diào)，提示抑制MFI2-AS1表達(dá)可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。

miR-331-3p在多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程[15-17]。但miR-331-3p在心功能障礙發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-331-3p的表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步研究顯示miR-331-3p過(guò)表達(dá)可明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡，并可促進(jìn)CyclinD1表達(dá)，抑制Cleaved-caspase-3表達(dá)，提示miR-331-3p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)CyclinD1表達(dá)及下調(diào)Cleaved-caspase-3表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)MFI2-AS1可靶向調(diào)控miR-331-3p的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示抑制miR-331-3p表達(dá)可明顯減弱抑制MFI2-AS1表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，及其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。提示抑制MFI2-AS1表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-331-3p表達(dá)從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。

綜上所述，抑制MFI2-AS1表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與MFI2-AS1靶向調(diào)控miR-331-3p的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)調(diào)控MFI2-AS1表達(dá)可增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖能力，改善心臟功能，可為闡明膿毒癥所致心功能障礙的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。