脂氧素A4抑制TLR4/NOX4/NF-κB通路減輕膿毒癥大鼠腦損傷的研究

朱國(guó)輝 魏鋒

膿毒癥是導(dǎo)致危重患者死亡的重要原因，在臨床上表現(xiàn)為感染和應(yīng)激條件下的多系統(tǒng)并發(fā)癥，其中包括腦損傷[1]。此外，膿毒癥還與多種流行病學(xué)因素導(dǎo)致的多種免疫相關(guān)信號(hào)通路異常激活有關(guān)[2]。盡管目前對(duì)于膿毒癥的研究進(jìn)展迅速，但膿毒癥的發(fā)病率仍然居高不下[3,4]。研究表明，機(jī)體的免疫功能紊亂是膿毒癥的重要病理生理機(jī)制，包括了過度炎性反應(yīng)和免疫抑制兩個(gè)方面[5]。促炎細(xì)胞因子在先天免疫反應(yīng)中的作用是膿毒癥病理生理學(xué)領(lǐng)域中研究最廣泛的方面之一。惡化的外周炎癥可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。隨后與膿毒癥相關(guān)的血腦屏障破壞促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中引發(fā)一場(chǎng)促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致膿毒癥幸存者的腦功能障礙[6]。膿毒癥的許多幸存者遭受長(zhǎng)期認(rèn)知障礙，經(jīng)歷過嚴(yán)重膿毒癥住院治療的患者出現(xiàn)中度至重度大腦皮層損傷的可能性是正常人的2倍多[7]。 這些慢性神經(jīng)功能障礙導(dǎo)致致命的不良后果，然而盡管投入了大量的時(shí)間和精力，與腦損傷相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療仍然缺乏成功的干預(yù)措施。Toll樣受體4(TLR4)是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要跨膜蛋白，可以充當(dāng)微生物傳感器來觸發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)，當(dāng)其與配體結(jié)合時(shí)，TLR4可誘導(dǎo)下游多種信號(hào)途徑[8]。NADPH氧化酶4(NOX4)是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要來源，越來越多的研究表明TLR4和NOX4的結(jié)合對(duì)于ROS的產(chǎn)生至關(guān)重要[9]。NF-κB是一種廣泛分布的轉(zhuǎn)錄因子，可以控制許多生物過程，包括炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用[10]。脂氧素A4(LXA4)是花生四烯酸的生物活性產(chǎn)物，已被證明具有很強(qiáng)的抗炎活性。有研究證明LXA4能降低膿毒癥大鼠血清白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α水平，減輕炎性反應(yīng)，該作用可能通過抑制TLR4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[11]。本研究探討脂氧素A4膿毒癥大鼠腦組織損傷中的作用，以及該保護(hù)作用與TLR4/NOX4/NF-κB通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和樣品的采集與處理 清潔級(jí)SD大鼠(購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物合格證號(hào)：110322210100605613)32只，體重約280 g，12周齡，術(shù)前禁食12 h。經(jīng)腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉。對(duì)腹部進(jìn)行常規(guī)消毒，并做一個(gè)約2 cm的切口。在腹腔中發(fā)現(xiàn)盲腸后，將遠(yuǎn)端盲腸和大腸之間的腸系膜分離并將盲腸遠(yuǎn)端結(jié)扎1/2，用針在中間穿刺，然后將盲腸放回腹腔，縫合腹部。正常對(duì)照組(S組)，不做結(jié)扎和穿刺外，其余步驟皆相同。脂氧素A4組(LXA4組)和TLR4激動(dòng)劑組(Pam組)按照該步驟建造盲腸結(jié)扎穿孔模型后，都進(jìn)行脂氧素A4 50 μg/kg腹腔注射，Pam組同時(shí)給予2 mg/kg的Pam3Cys腹腔注射。模型完成12 h，經(jīng)腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉大鼠，從下腔靜脈收集血液并離心，收集血清并儲(chǔ)存在-80℃用于檢測(cè)血清生化指標(biāo)。取腦組織，分別放在甲醛固定溶液中用于隨后的蘇木精-伊紅(HE)染色試驗(yàn)(中國(guó)武漢博斯特)，剩余的儲(chǔ)存在-80℃用于測(cè)量mRNA、酶活性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.2 HE染色法觀察4組腦組織的病理變化 取出固定在組織固定溶液中的腦組織，用自動(dòng)包埋機(jī)包埋石蠟進(jìn)行石蠟切片，厚度為5 mm。接下來，將切片脫蠟和梯度脫水，最后干燥的薄片用蘇木精染色20 min，用鹽酸和乙醇溶液分離30 s，用曙紅染色12 min，用90%乙醇分離45 s，封片晾干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定炎性因子含量 血清炎性因子是腦損傷的重要指標(biāo)，能夠指示損傷修復(fù)的程度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒和所有試劑在室溫下緩沖30 min，制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后孵育，加入生物素標(biāo)記的抗體，孵育，洗滌。隨后，根據(jù)實(shí)際情況的說明，檢測(cè)所有指標(biāo)的變化。最后，使用微孔板讀數(shù)器讀取各組炎癥因子的吸光度從分算出炎性因子的含量。

1.4 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性的檢測(cè) 為了觀察中性粒細(xì)胞在腦部的浸潤(rùn)情況而進(jìn)行MPO的活性測(cè)定。將儲(chǔ)存在-80℃的腦組織小心地取出并放在冰上。然后，將組織加入裂解溶液并進(jìn)行低溫均質(zhì)化，隨后離心。接下來，收集上清液，用分光光度法測(cè)定大腦勻漿中的MPO活性。結(jié)果以mg表示。

1.5 各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量檢測(cè) 在每組處死大鼠之前，根據(jù)Longa 5分評(píng)分法對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分為6個(gè)等級(jí)：0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)，大 鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒。重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失；5分：死亡。將得分最高和最低的大鼠丟棄。在實(shí)驗(yàn)過程中，具有其他臨床癥狀的大鼠也被丟棄，并且以隨機(jī)方式對(duì)大鼠進(jìn)行強(qiáng)化。采用干濕重法檢測(cè)腦組織含水量。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)TLR4/NOX4/NF-κB通路相關(guān)基因表達(dá) 從每組大鼠中提取腦組織勻漿，并使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒提取總RNA。用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核糖核酸的濃度、純度和完整性，在符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)后，根據(jù)操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。GAPDH引物：上游5’-GGTGGTCATATGACAAAACTTGAAGAG-3’，下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’;TLR4引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’；NOX4引物：上游 5’-TGCATGGTGGTGGTATTGTTCCTC-3’，下游5’-AGCAGCAGCAGCATGTAGAAGAC-3’；NF-κB引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游 5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’。按說明書的方法步驟配制反應(yīng)體系，經(jīng)過94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用比較閾值法定量分析，計(jì)算方法為：目的基因定量拷貝數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-內(nèi)參基因 Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 實(shí)驗(yàn)組-ΔCt 對(duì)照組，對(duì)每一標(biāo)本計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)

1.7 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 稱重冷凍腦組織樣品并在冰上研磨。加入RAPA裂解液制成勻漿，在冰上裂解30 min，每10分鐘震蕩1次，直到組織完全溶解以釋放組織蛋白。此后，將混合物離心，收集上清液。根據(jù)雙喹啉酸(BCA)試劑盒的說明進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定的，然后計(jì)算每種蛋白質(zhì)的濃度。最后加入5×上樣緩沖液于100℃下變性10 min。配置12%分離膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。此后，在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1.5 h，加一抗GAPDH、TLR4、NOX4、NF-κB(1∶1 000稀釋)在4℃下孵育過夜，TBST清洗后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，加入顯色液，凝膠成像系統(tǒng)用于顯影和成像。GAPDH用于校正待測(cè)蛋白質(zhì)的水平。最后，分析各個(gè)蛋白質(zhì)條帶的灰度值。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠腦組織病理的變化 S組神經(jīng)細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，神經(jīng)元形態(tài)正常，頂膜清晰，腦組織皮質(zhì)核均勻清晰；CLP組和Pam組出現(xiàn)異常和紊亂的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，基本結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)空泡；LXA4組的病理?yè)p傷程度明顯減輕，基本結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)正常。見圖1。

圖1 腦組織病理的變化 (黑色箭頭標(biāo)記受損神經(jīng)元，HE×200)

2.2 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性比較 與S組相比，其余3組的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均有升高(P<0.05)；而和CLP組相比，LXA4組的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均明顯下降(P<0.05)；CLP組和Pam組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性比較

2.3 4組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量比較 與S組相比，其余3組的腦功能評(píng)分和腦組織含水量均有所提高(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的腦功能評(píng)分和腦組織含水量均明顯降低(P<0.05)；CLP組和Pam組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量比較

2.4 4組大鼠腦組織qRT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果 與S組相比，其余3組的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA 的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；CLP組和Pam組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠腦組織qRT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

2.5 信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)結(jié)果 與 S組相比，其余3組的TLR4、NOX4和NF-κB的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的TLR4、NOX4和NF-κB的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；CLP組和Pam組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表4。

圖2 4組大鼠腦組織TLR4、NOX4和NF-κB的表達(dá)量

表4 4組大鼠腦組織TLR4、NOX4和NF-κB的表達(dá)量

3 討論

隨著膿毒癥研究的深入，膿毒癥的進(jìn)展逐漸變得清晰。膿毒癥的臨床病理過程主要包括細(xì)胞因子風(fēng)暴、炎癥介質(zhì)增加、腸道細(xì)菌移位、內(nèi)毒素血癥以及凝血系統(tǒng)與炎癥的相互作用[12-14]。膿毒癥通常伴隨著組織和器官的損傷，這是高死亡率的原因之一[15]。膿毒癥會(huì)導(dǎo)致腦損傷，從而導(dǎo)致慢性神經(jīng)功能障礙(包括大腦和認(rèn)知麻痹以及其他缺陷)，對(duì)患者的預(yù)后造成嚴(yán)重影響[16]。然而，關(guān)于腦損傷相關(guān)神經(jīng)疾病的治療，仍然缺乏成功的干預(yù)措施。因此，迫切需要新的治療方法，為膿毒癥及其并發(fā)癥的防治提供依據(jù)。本研究建立膿毒癥大鼠模型，研究脂氧素A4的治療作用及其具體作用機(jī)制。

脂氧素A4(LXA4)，是一種由花生四烯酸產(chǎn)生的內(nèi)源性脂氧合酶衍生的類花生酸介體，它對(duì)各種細(xì)胞類型具有強(qiáng)大的雙重抗炎和促分解作用。在膿毒癥大鼠模型中，LXA4能降低血清IL-6和TNF-α水平，減輕炎性反應(yīng)，并且能抑制膿毒癥大鼠肝臟中TLR4和TRAF6的表達(dá)，表明LXA4的抗炎作用可能通過抑制TLR4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[17]。多項(xiàng)研究表明LXA4 可抑制白細(xì)胞介導(dǎo)的損傷，促進(jìn)單核細(xì)胞的趨化性和吞噬作用并且抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞增殖，已被多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明具有治療潛力[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性均明顯上升，而給予LXA4干預(yù)治療后，血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性均明顯下降，表明炎性反應(yīng)有所減輕。由于腦損傷時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)慢性神經(jīng)功能障礙，包括腦性癱瘓和認(rèn)知及其他缺陷，我們對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行了評(píng)分。結(jié)果顯示，膿毒癥組部分大鼠不能行走，全身向?qū)?cè)屈曲，同時(shí)伴隨著腦水腫，正常組大鼠無異常，LXA4干預(yù)治療組大鼠與對(duì)照組大鼠狀態(tài)相似，腦水腫程度也有所減輕。HE染色結(jié)果顯示，膿毒癥組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常紊亂，基本結(jié)構(gòu)被破壞，LXA4干預(yù)治療組腦組織基本結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)清晰，皮質(zhì)核均勻清晰。然而，LXA4治療的基礎(chǔ)上同時(shí)給予TLR4激動(dòng)劑劑Pam3Cys干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXA4的治療效果被中和，表明LXA4的治療作用可能與抑制TLR4及其下游通路有關(guān)。

TLR4的激活及其下游信號(hào)通路在膿毒癥致腦損傷機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[21,22]。NOX4 是NADPH 氧化酶亞型的一種，在血腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元中特異性表達(dá)，在缺血或缺氧時(shí)被誘導(dǎo)，將氧轉(zhuǎn)化為活性氧，在小鼠心臟、大腦和后肢缺血模型中顯示，只有在大腦中NOX4才會(huì)導(dǎo)致缺血性損傷[23]。在脂多糖的刺激下，NOX4的COOH末端區(qū)域可以直接偶聯(lián) TLR4并誘導(dǎo) NF-κB激活。為了進(jìn)一步分析TLR4及其下游信號(hào)通路的作用，我們用qRT-PCR 檢測(cè)了各組大鼠腦組織中TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)量，Western blot 檢測(cè)了各組大鼠腦組織中TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥組無論是TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)量還是TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表達(dá)量都明顯上升，而LXA4干預(yù)治療組，TLR4及其下游的信號(hào)通路蛋白從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都有明顯的降低，與此同時(shí)膿毒癥的炎性反應(yīng)和腦損傷作用也同時(shí)降低，給予TLR4激動(dòng)劑劑Pam3Cys干預(yù)，TLR4及其下游信號(hào)通路被激活，炎性反應(yīng)和腦損傷相較于治療組加重。以上結(jié)果共同說明了TLR4/NOX4/NF-κB通路參與了膿毒癥致腦損傷的致病過程。

綜上所述，TLR4/NOX4/NF-κB通路參與了膿毒癥致腦損傷的致病過程，脂氧素A4通過抑制膿毒癥大鼠腦組織中TLR4/NOX4/NF-κB通路的破壞作用，從而抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1和IL-6表達(dá)活性以及膿毒癥大鼠炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，最終影響膿毒癥誘導(dǎo)的腦損傷的進(jìn)展。