重離子束輻射對(duì)海帶配子體克隆的影響

趙聚萍，羅世菊，李曉捷，武瑞娜

（山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

海帶作為一種大型經(jīng)濟(jì)海藻，在工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用。我國(guó)是較早進(jìn)行比較系統(tǒng)的遺傳育種研究的國(guó)家, 配子體克隆技術(shù)的運(yùn)用，使海帶的種質(zhì)得以長(zhǎng)久保存，并且通過配子體雜交技術(shù)培育海帶新品種，解決了傳統(tǒng)育苗育種選育周期長(zhǎng)、優(yōu)良性狀容易退化等問題。為了豐富育種素材，采用物理誘變等方式誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生變異，能縮短獲得優(yōu)良變異植株的時(shí)間。

目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要育種方式有：雜交育種、誘變育種、單倍體育種、多倍體育種以及基因工程育種。其中誘變育種根據(jù)作用機(jī)理的不同，主要分為化學(xué)誘變和物理誘變。X 射線、γ 射線、ARTP、紫外線和重離子等是目前進(jìn)行物理誘變的主要方法。早在20 世紀(jì)80 年代就利用重離子誘變開展初步試驗(yàn)。重離子輻射屬于電離輻射的一種，其基本作用機(jī)理同X 射線和γ 射線相同，但是重離子束單位劑量的誘變效率是X 射線和γ 射線等低LET 方法的10 倍[1]。重離子輻射的突出優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在生物品種改良及選育。目前，在農(nóng)作物、微生物等方面已經(jīng)利用重離子輻射篩選獲得多個(gè)有利突變體[2-4]；重離子束輻照在條斑紫菜、海帶等大型海藻遺傳育種方面取得初步研究效果[5-7]。

現(xiàn)利用12C 重離子束對(duì)種質(zhì)庫保存的8 個(gè)配子體克隆系進(jìn)行3 次輻射試驗(yàn)，通過觀察輻射后海帶配子體細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞死亡情況，判斷重離子束輻射對(duì)海帶配子體的作用范圍，以確定海帶配子體重離子輻射的適合劑量范圍，為豐富育種素材，進(jìn)一步進(jìn)行海帶重離子束輻射育種提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的材料為山東東方海洋科技股份有限公司種質(zhì)庫中保存的海帶配子體克隆。第一次輻射材料分別為：019601016、019601001、169901002、169901003、2503 ♀混、2503 ♂混、481003002 和YDJ491004006，共8 個(gè)克隆系；第二次輻射材料分別為：019601016、019601001、2503♀混、2503♂混、481003002 和YDJ491004006 共6 個(gè)克隆系；第三次輻射材料分別為：019601016 和169901002，共2個(gè)克隆系。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎儀、400 目篩絹、500 mL 燒杯、玻璃板、3.5 cm 培養(yǎng)皿、9 cm 培養(yǎng)皿、2 mL 凍存管、200 μL 離心管、100 mL 錐形瓶、顯微鏡等。

1.3 試驗(yàn)方法

第一次試驗(yàn)：將8 個(gè)克隆系的克隆用超聲波細(xì)胞粉碎儀打碎，超聲波設(shè)定功率為200 W，共超聲6 次，10 s/次，間隔時(shí)間6 s。將打碎后的克隆經(jīng)400 目篩絹過濾，得到1～4 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞段濾液，倒入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，預(yù)培養(yǎng)10 d。將預(yù)培養(yǎng)后的克隆進(jìn)行收集，裝入2 mL 的凍存管運(yùn)輸，每個(gè)克隆系各裝12 支。輻射劑量為10，20，40，50 和60 Gy，每個(gè)輻射劑量2 支，對(duì)照組2 支。

第二次試驗(yàn)：將6 個(gè)克隆系克隆團(tuán)直接裝入200 μL 離心管運(yùn)輸，每個(gè)克隆系各裝12 管，12 管一組裝于直徑3.5 cm 的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，兩皿底對(duì)扣封口膜密封。輻射劑量為80、120、160、200 和240 Gy，每個(gè)輻射劑量2 管，對(duì)照組2 管。

第三次試驗(yàn)：將2 個(gè)克隆系克隆團(tuán)直接裝入200 μL 離心管運(yùn)輸，每個(gè)克隆系各裝12 管，12 管一組裝于直徑3.5 cm 的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，兩皿底對(duì)扣封口膜密封。輻射劑量為60、80、120、160 和200 Gy，每個(gè)輻射劑量2 管，對(duì)照組2 管。

試驗(yàn)流能量為80 Mev，劑量率為50 Gy/min。輻射完成后，材料運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入100 mL 錐形瓶?jī)?nèi)，放入冷藏箱內(nèi)自然光下培養(yǎng)。冷藏箱溫度為8～12 ℃，每周換水、鏡檢1 次，觀察克隆狀態(tài)。

2 結(jié)果分析

2.1 第一次輻射試驗(yàn)

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對(duì)照組比較，沒有明顯變化，不同輻射劑量之間也沒有明顯差別；170 d 鏡檢觀察輻射組細(xì)胞形態(tài)色澤，與對(duì)照組比較有變化，輻射組細(xì)胞生長(zhǎng)不如對(duì)照組舒展，稍有些圓。180 d 鏡檢發(fā)現(xiàn)輻射對(duì)雌細(xì)胞影響較大，其中2 個(gè)60 Gy 雌克隆系個(gè)別細(xì)胞膨大、不分裂直至死亡（圖1），或者一個(gè)細(xì)胞分裂成含10 多個(gè)細(xì)胞球狀體，色素正常；雄克隆系變化不明顯；對(duì)照組克隆細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均正常。

圖1 海帶配子體克隆雌性

2.2 第二次輻射試驗(yàn)

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對(duì)照組相比沒有明顯差別，各試驗(yàn)組不同輻射劑量之間也沒有明顯差別。50 d 鏡檢，出現(xiàn)細(xì)胞膨大、死亡，對(duì)照組克隆細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好。83 d鏡檢，不同克隆系各輻射組死亡細(xì)胞明顯增多，不同克隆系間表現(xiàn)稍有差別，輻射劑量越大細(xì)胞死亡越多，160 Gy 輻射劑量下克隆系除少部分細(xì)胞生長(zhǎng)正常，大部分細(xì)胞膨大、趨于死亡或死亡，200 和240 Gy 輻射劑量下克隆系細(xì)胞幾乎全部膨大、趨于死亡或死亡；對(duì)照組克隆細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均正常。180 d鏡檢，有存活細(xì)胞的輻射組逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)。第二批克隆存活情況見表1。

2.3 第三次輻射試驗(yàn)

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對(duì)照組相比沒有明顯差別，不同輻射劑量的各試驗(yàn)組之間也沒有明顯差別。75 d 鏡檢，輻射克隆細(xì)胞膨大、死亡，對(duì)照組克隆細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好。90 d 鏡檢，不同克隆系各輻射組死亡細(xì)胞明顯增多（圖2 和圖3）。110 d 鏡檢，隨輻射劑量的增大，克隆死亡情況逐漸增加，160 Gy 輻射劑量下除少部分細(xì)胞還存活，大部分細(xì)胞膨大、死亡或趨于死亡；輻射劑量200 Gy 下的克隆細(xì)胞幾乎全部膨大、死亡或趨于死亡。120 d 鏡檢，輻射劑量60 Gy 下細(xì)胞存活率約為80%～90%，輻射劑量80 Gy 下細(xì)胞存活率約為50%～60%。180 d 鏡檢，除編碼為169901002的海帶配子體克隆細(xì)胞在200 Gy 輻射劑量下沒有細(xì)胞存活，其余劑量下輻射材料均逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)；對(duì)照組克隆細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均正常。

表1 第二批海帶配子體重離子輻射后細(xì)胞存活情況

圖2 編碼為019601016 的海帶配子體細(xì)胞在不同輻射劑量下90 d 鏡檢結(jié)果

圖3 編碼為169901002 的海帶配子體細(xì)胞在不同輻射劑量下90 d 鏡檢結(jié)果

3 討論

第一次試驗(yàn)考慮到重離子輻射的穿透性，先將海帶配子克隆利用超聲波打碎，預(yù)培養(yǎng)10 d，待克隆狀態(tài)恢復(fù)后進(jìn)行輻射。而第二、三次試驗(yàn)為了避免超聲波打碎影響海帶配子體細(xì)胞的狀態(tài)而直接對(duì)克隆團(tuán)進(jìn)行輻射。

由試驗(yàn)結(jié)果可見，利用12C 重離子束對(duì)海帶配子體克隆進(jìn)行輻射，使配子體細(xì)胞發(fā)生變化的最低輻射劑量為60 Gy；隨著輻射劑量的增大，細(xì)胞死亡增多；240 Gy 輻射劑量下，僅編碼為481003002 的海帶配子體的一個(gè)克隆系有存活，80 Gy 輻射劑量下細(xì)胞存活率約為50%～60%。

不同海帶配子體克隆系對(duì)于重離子輻射的耐受力也有差別，海帶雄配子體比雌配子體耐受力稍強(qiáng)。第二次試驗(yàn)中編碼為YDJ491004006 的海帶配子體克隆各輻射劑量下細(xì)胞存活率略低于其他同輻射劑量下的海帶配子體克隆系，這可能與海帶配子體自身的狀態(tài)有關(guān)，運(yùn)輸時(shí)間、溫度等因素可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。

定期觀察輻射后海帶配子體細(xì)胞的狀態(tài)。前期，海帶配子體細(xì)胞無論形態(tài)還是色澤方面與對(duì)照組相比都沒有明顯變化。約2 個(gè)月后，差異逐漸表現(xiàn)出來，有的細(xì)胞膨大、趨于死亡或死亡，而有的細(xì)胞鏡檢一直無明顯變化，細(xì)胞形態(tài)、色澤均正常，但能因輻射受到損傷不分裂不生長(zhǎng)，最終死亡。

4 結(jié)論

通過3 次重離子束輻射海帶配子體克隆試驗(yàn)，可大體判斷重離子束輻射對(duì)海帶配子體起作用的劑量為60～240 Gy。

重離子輻射可能誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生大量變異，對(duì)輻射后的海帶配子體克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、育苗，期待能在較短時(shí)間內(nèi)獲得具有優(yōu)良性狀的變異植株，分離、保存與優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因；還可以結(jié)合海帶配子體克隆細(xì)胞雜交技術(shù)獲得數(shù)量多、種類多的突變植株[7]。同時(shí)，利用海帶配子體克隆培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)目標(biāo)植株的配子體細(xì)胞，可以作為新的海帶遺傳資源進(jìn)行保存，豐富海帶種質(zhì)資源庫。