普通小麥籽粒硬度的全基因組關(guān)聯(lián)分析

胡文靜，張 曉，劉 巧，方正武，高德榮，

(1. 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所/農(nóng)業(yè)部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州225007； 2.揚州大學/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009； 3.長江大學農(nóng)學院，湖北荊州 434025)

籽粒硬度是決定小麥市場分級、碾磨性能和最終用途的重要指標和依據(jù)[1]。根據(jù)籽粒硬度性狀的不同，可以將小麥分為軟麥、混合麥和硬麥。不同硬度類別的小麥具有不同的使用價值。硬質(zhì)麥面粉顆粒度大，破損淀粉含量高,吸水能力較強,適合制作面包和優(yōu)質(zhì)面條等食品；軟質(zhì)麥面粉顆粒度較小，破損淀粉含量低，吸水能力較弱，適合制作餅干和糕點等食品[2]。籽粒硬度對小麥磨粉品質(zhì)、淀粉品質(zhì)、蛋白質(zhì)品質(zhì)和加工品質(zhì)都有顯著的影響[3-5]。趙 新等[6]發(fā)現(xiàn)，隨著硬度指數(shù)的增加，小麥面粉的出粉率和蛋白質(zhì)含量逐漸升高，淀粉含量逐漸降低，同時籽粒硬度增加對面包品質(zhì)的改良效果比面條品質(zhì)更為明顯，原因可能與硬度較大的硬質(zhì)小麥面團具有較高的彈性和較弱的延展性有關(guān)。吳宏亞等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，出粉率和灰分含量與籽粒硬度的變化趨勢成正比。姜蘭芳等[8]發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒硬度指數(shù)與出粉率、吸水率和最大拉伸阻力均呈極顯著正相關(guān)。夏云祥等[9]發(fā)現(xiàn)，除蔗糖溶劑保持力(solvent retention capacity，SRC)外，籽粒硬度與小麥粉水SRC、碳酸鈉SRC和乳酸SRC均呈極顯著相關(guān)。多數(shù)研究結(jié)果表明，不同puroindoline基因型間籽粒硬度存在顯著差異[10-12]。

籽粒硬度由1對主效基因和一些微效修飾基因控制，主效基因puroindolinea(Pina)和puroindolineb(Pinb)位于5DS染色體上，已發(fā)現(xiàn)的微效基因主要位于1A、2A、2D、3A、5A、5B和6D染色體上[13-17]。Wang等[18]利用“超軟”小麥構(gòu)建的重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體發(fā)現(xiàn)，控制軟質(zhì)小麥籽粒硬度和出粉率的2個主效位點Qkha.orr-4B和Qkha.orr-4D分別位于4B和4D染色體上，與小麥矮稈基因Rht-B1和Rht-D1位置接近，可解釋籽粒硬度20%～34%的表型變異。

小麥雙親群體連鎖分析理論上可以應(yīng)用于所有性狀的遺傳解析，但受遺傳群體親本的差異度和群體大小等限制，定位QTL的來源和數(shù)目有限[19]。而關(guān)聯(lián)分析則是以自然群體中的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，鑒定目標性狀與遺傳標記或者候選基因之間非隨機關(guān)聯(lián)程度，從而確定關(guān)聯(lián)位點[20]。由于關(guān)聯(lián)分析研究對象為自然群體，材料相對廣泛，是解析復雜性狀和鑒定目標性狀優(yōu)異等位變異的有效方法[21-22]。該技術(shù)已在大豆、玉米、水稻等作物遺傳研究應(yīng)用較多[23-24]，在小麥的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性等遺傳研究上也被廣泛采用[25-28]。

近年來，籽粒硬度這一品質(zhì)特性已越來越引起小麥育種工作者和面粉加工企業(yè)的重視，張 曉等[29]認為，籽粒硬度可以作為品質(zhì)育種高效實用的選擇指標，優(yōu)質(zhì)弱筋小麥育種需加強軟質(zhì)基因型的篩選。而以自然群體為材料用關(guān)聯(lián)分析的方法對小麥籽粒硬度基因開展的研究還未見報道。本研究以171個小麥品種組成的自然群體為材料，利用小麥90K SNP芯片對籽粒硬度進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)，以期發(fā)掘與小麥籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點，為小麥硬度的分子標記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料來自中國農(nóng)業(yè)科學院和江蘇省農(nóng)科院，由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所搜集，包括國內(nèi)外171個小麥品種，其中，3個分別來自意大利、墨西哥和日本，其余168個分別來自我國陜西、河北、北京、山西、山東、河南、安徽、江蘇、湖北、湖南、四川和廣州17個省市[31]。供試材料于2017-2018和2018-2019年度分別種植于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所萬?；睾徒K省高郵市小麥試驗基地(簡稱2018YZ、2018GY、2019YZ和2019GY)，秋播時0～20 cm耕層土壤有機質(zhì)含量16.57 g·kg-1，堿解氮含量71.89 mg·kg-1，速效磷含量17.65 mg·kg-1，速效鉀含量59.28 mg·kg-1，全氮含量1.23 g·kg-1，全磷含量0.59 g·kg-1，全鉀含量11.98 g·kg-1。試驗當年小麥播期為10月25日，全生育期施270 kg·hm-2純氮，基肥∶壯蘗肥∶拔節(jié)肥= 5∶4∶1，基肥于播種前一天施用，壯蘗肥于4葉期施用，拔節(jié)肥于葉齡余數(shù)2.5葉期施用。P2O5、K2O肥施用量均為105 kg·hm-2，全部基施。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，3行區(qū)，2次重復，每行60粒，行長 1.33 m，行距0.23 m。生育期田間管理同當?shù)卮筇锷a(chǎn)，及時防治病蟲草害，成熟期分區(qū)收獲并清理籽粒樣本，無穗發(fā)芽發(fā)生。為了減少誤差，將經(jīng)清理的2個重復的種子等量混合作為最終試驗籽粒樣本。

1.2 籽粒硬度測定

采用瑞典波通(Perten)儀器公司的單粒谷物特性測定儀(SKCS-4100)測定供試材料的籽粒硬度，2次重復，取平均值。

1.3 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 22.0和Excel 2019對表型數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

1.4 基因型分析

運用小麥90 K SNP芯片(81 857個SNP)對171個小麥品種進行基因分型。人工對分型結(jié)果進行質(zhì)量控制，剔除數(shù)據(jù)缺失率>10%和最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)< 0.05的SNP標記，保留高質(zhì)量的SNP標記進行關(guān)聯(lián)分析。參考Hu等[30]的方法利用Tassel v5.0對171個小麥品種的基因型進行LD分析，根據(jù)LD分析結(jié)果選用平均分布于21條染色體上的1 676個標記(r2<0.2)，利用Structure 2.3.4進行群體結(jié)構(gòu)分析，采用Tassel v5.0進行親緣關(guān)系評估(kinship matrix，K matrix)運算。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

在考慮群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的情況下(Q+K)，應(yīng)用Tassel v5.0中的混合線性模型(mixed linear model，MLM)進行籽粒硬度性狀與SNP標記之間的關(guān)聯(lián)分析。在全基因組范圍內(nèi)檢測與目標性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標記位點的分布情況(如位于哪一染色體及其在對應(yīng)染色體上的位置)及其對應(yīng)的-log10(P)值。當標記的-log10(P)≥3，即P≤0.001時認為標記與性狀存在關(guān)聯(lián)。結(jié)果中多個標記是否位于同一位點由對應(yīng)基因組的LD衰減距離決定。為了與前人結(jié)果比較，將連鎖標記或者基因的序列與EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)中的中國春參考基因組序列進行比對，獲得連鎖標記或者基因的物理位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型分析

參考Hu等[30]的分析結(jié)果，基因型過濾后有23 556個SNPs。利用平均分布于21條染色體上的1 676個標記(r2<0.2)進行群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果(圖1)表明，供試的171個小麥品種可分為2個亞群。亞群1包括99個小麥品種，主要來自安徽、江蘇、河南、陜西和湖南；亞群2包括72個小麥品種，主要來自河南、江蘇、山東和山西。LD衰減距離分析結(jié)果表明，自然群體中A、B和D基因組分別含有39.7%、50.0%和24.0%的顯著性標記，LD衰減距離分別為10、9.5和12 Mb，全基因組的LD衰減距離為10.5 Mb。

2.2 小麥籽粒硬度的變異

171個小麥品種在2018YZ、2018GY、2019YZ和2019GY四個環(huán)境下的硬度平均值分別為27.41、30.73、24.15和26.88，變異系數(shù)為56.59%～66.80%，說明供試材料的籽粒硬度的變異范圍廣，具有較大的選擇潛力。供試小麥品種的籽粒硬度在不同環(huán)境之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)范圍為0.88～0.92(表1)。

圖1 171個小麥品種的群體結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Population structure analysis of 171 wheat cultivars

2.3 小麥品種籽粒硬度的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

結(jié)果(圖2，表2)表明，與小麥籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)的SNPs有20個，分別位于1A(5個)、1B(4個)、1D(1個)、2A(1個)、5A(3個)、7A(4個)和7B(1個)染色體上，可解釋6.76%～ 11.79%的表型變異。其中，在2個及以上環(huán)境中檢測到的SNP標記有14個，參考Hu等[30]前期LD 衰減距離分析結(jié)果，即同一條染色體上顯著性標記之間物理距離小于對應(yīng)基因組的LD衰減距離可以視為同一位點，將這14個SNP標記可歸納為7個位點，分別位于1A、1B、1D、2A、5A和7A染色體上，可解釋 6.76%～11.79%的表型變異，其中，1A染色體上有2個位點，其他5條染色體上分別有1個位點。14個SNPs中表型變異率超過10%的有4個，其中，1D染色體上的標記 wsnp_Ku_c19622_29138795在3個環(huán)境中能被檢測到，可解釋9.08%～11.79%的表型變異；2A染色體上的標記Excalibur_c12675_1789在4個環(huán)境中均能被檢測到，可解釋9.10%～10.86%的表型變異；5A染色體上的標記wsnp_Ra_c24707_34262900和BS00041219_51在3個環(huán)境中能被檢測到，可解釋6.76%～10.35 %的表型變異。

表1 171個小麥品種籽粒硬度的描述性統(tǒng)計分析Table 1 Descriptive statistics of grain hardness of 171 wheat varieties

圖2 全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖Fig.2 Manhattan plots for genome-wide association study

表2 與171個小麥品種籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)的SNPs標記Table 2 SNPs significantly associated with grain hardness in 171 wheat varieties

3 討 論

4個環(huán)境下小麥籽粒硬度的統(tǒng)計學分析結(jié)果表明，自然群體的表型變異范圍廣，具有較大的選擇潛力，環(huán)境對該表型影響較小，說明小麥籽粒硬度主要受遺傳因素控制，應(yīng)在育種的早期世代對其進行選擇，這與前人研究結(jié)果一致[31]。本研究利用90K SNP芯片對171個小麥品種在四個環(huán)境下的籽粒硬度進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到20個與籽粒硬度顯著相關(guān)的SNPs，其中，在2個及以上環(huán)境中檢測到的SNPs有14個，共7個位點，分別位于1A(362.05 Mb、402.81～403.03 Mb)、1B(433.43～434.56 Mb)、1D(28.49 Mb)、2A(773.18 Mb)、5A(46.23 Mb)、7A(57.87 Mb)染色體上，可解釋6.76%～ 11.79%的表型變異。14個SNPs中表型變異率超過10%的有4個，分別位于1D、2A和5A染色體上，可以優(yōu)先考慮選擇這些貢獻率較大的位點進一步精細定位、圖位克隆及育種標記開發(fā)，檢測軟質(zhì)或者硬質(zhì)相關(guān)分子標記來選擇相應(yīng)的小麥品種，進而改良小麥籽粒硬度。

前人研究結(jié)果表明，小麥籽粒硬度不僅受到5DS染色體上主效基因(Ha)控制，還受到其他染色體上微效基因的影響[13-17,32]。李文福等[33]以小麥品種花培3號、豫麥57構(gòu)建的DH群體和IF2群體為材料，利用368個SSR標記定位了控制硬度的QTL位點，分別位于1B、2A、4B、5A、6A和7D染色體上，經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)5A染色體上的QTL與本研究在5A染色體上定位到的顯著性位點物理位置一致，推測是同一位點。王雪榮[34]利用205個小麥品種構(gòu)成的自然群體，結(jié)合SNPs、DArt和SSR標記構(gòu)建復合遺傳圖譜，在三個環(huán)境中檢測到128個與籽粒硬度相關(guān)和29個與硬度指數(shù)相關(guān)的位點，其中1D染色體上的標記Kukri_c3150_1519、wsnp_Ku_c3682_6786230與本研究檢測到的wsnp_Ku_c19622_29138795位置接近，推測是同一位點。楊 林等[35]利用小麥中國春(母本)和蘭考大粒(父本)F2:3家系構(gòu)建的含有169個多態(tài)性分子標記的遺傳連鎖圖譜，共檢測到17個與小麥籽粒硬度性狀顯著相關(guān)的QTL，并在1B染色體上發(fā)現(xiàn)存在同時控制籽粒容重、硬度、蛋白和結(jié)合水含量的QTL，本研究也在1B染色體上發(fā)現(xiàn)4個與硬度性狀顯著相關(guān)的標記，包含1個穩(wěn)定表達的位點，與前人研究物理位置一致，推測是同一位點，也證實了1B染色體對小麥品質(zhì)的顯著影響。

本研究發(fā)現(xiàn)在所有環(huán)境下與小麥籽粒硬度性狀均相關(guān)的位點有4個，分別位于1A(402.81～403.03 Mb)、1B(434.56 Mb)、2A(773.18 Mb)和7A(57.87 Mb)染色體上，但是只有2A染色體上的位點對小麥籽粒硬度的貢獻率超過10%，值得進一步研究。經(jīng)過比對，本研究在1A、2A、7A和7B染色體上檢測到的與小麥籽粒硬度顯著關(guān)聯(lián)的位點不同于前人研究結(jié)果，推測是新的籽粒硬度基因位點。

4 結(jié) 論

本研究利用171個小麥品種組成的自然群體，結(jié)合覆蓋小麥全基因組的90K SNP芯片，對小麥籽粒硬度進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到20個顯著關(guān)聯(lián)的SNPs，包含12個位點，在2個及以上環(huán)境中能被檢測到的共有7個位點，其中，表型變異率超過10%的有3個，分別位于1D、2A和5A染色體上，在所有環(huán)境下均能被檢測到的位點有4個，分別位于1A、1B、2A和7A染色 體上。