白粉病菌侵染條件下小麥酵母雙雜交文庫的構(gòu)建及可用性檢測

王巧慧，谷建華，郭 歡，呂士凱，吉萬全,張 宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.陜西省留壩縣種子管理站，陜西留壩 724100)

小麥作為人類主糧之一，為人類提供五分之一的能量營養(yǎng)供給[1]，是全球貿(mào)易總額超過其他所有作物總和的經(jīng)濟(jì)作物[2]。但由禾本科布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf. sp.tritici)引起的小麥白粉病造成小麥嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，在中國部分地區(qū)白粉病可導(dǎo)致小麥高達(dá)40%的減產(chǎn)[3-4]。據(jù)估計，截至2050年，小麥產(chǎn)量每年需增加2.4%才能滿足未來人類的糧食需求，而目前糧食增產(chǎn)僅為0.9%[5]。因此，提高小麥抗白粉病能力、降低白粉病的感染面積和發(fā)病程度可有效增加小麥產(chǎn)量。

探明白粉菌的侵染機(jī)制和小麥抗病的分子機(jī)制，是利用分子技術(shù)培育抗病品種的基礎(chǔ)。小麥抗病的遺傳基礎(chǔ)分為單基因抗性和多基因抗性[6]，白粉菌小種的不斷變異導(dǎo)致抗病小麥品種抗性喪失，因此，需在抗性基因庫中不斷發(fā)現(xiàn)新的抗性基因。隨著基因組測序的快速發(fā)展，功能組學(xué)研究也成為熱門，研究蛋白質(zhì)功能的其中一個方法就是找出與其互作的蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。大多數(shù)蛋白都存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，與之相互作用的蛋白質(zhì)也被認(rèn)為參與同一細(xì)胞內(nèi)的相同生物過程，從而對探究未知蛋白質(zhì)的功能提供線索。酵母雙雜交技術(shù)是一種可高通量檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞內(nèi)檢測技術(shù)[7]，該技術(shù)可檢測微弱的或是短暫的相互作用，還可以提供對蛋白質(zhì)穩(wěn)定和正確折疊所必須的修飾。cDNA的便于克隆和大量表達(dá)，使得從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因以及構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)更加便捷。因此，為解析小麥防御機(jī)制，構(gòu)建白粉菌侵染下小麥的cDNA文庫就顯得更加重要。

熱激蛋白在植物體中廣泛存在，依據(jù)分子量的不同，可將其分為小分子量熱激蛋白和大分子量熱激蛋白[8-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白不僅在高溫、低溫、干旱、鹽等非生物脅迫下大量積累，而且還參與抗病蟲害信號傳導(dǎo)過程，在生物脅迫中也發(fā)揮重要作用。王付娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白與其他蛋白具有分子伴侶功能，在其他輔助伴侶蛋白作用下促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，在逆境脅迫下參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。HSP40-70是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的大分子量熱激蛋白，有助于蛋白質(zhì)折疊和分解，防止蛋白質(zhì)錯誤折疊或聚集[11]。因此，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選小麥酵母文庫，得到與抗逆蛋白HSP40-70互作的蛋白，并分析該蛋白功能，以檢測該文庫的可用性和準(zhǔn)確性，以期為植物抗逆機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為小麥種質(zhì)N9134，由阿勃非整倍體與野生二粒小麥AS846雜交選育而成，該材料對中國境內(nèi)目前所有的白粉病菌生理小種都表現(xiàn)為高抗至免疫。將其種植于18 ℃光照16 h/黑暗8 h的人工培養(yǎng)箱中，待長至三葉期時，接種白粉病菌小種BgtE09，48 h后進(jìn)行取樣。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

接種白粉病菌48 h后，剪取小麥葉片，設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。使用Takara MiniBEST Plant RNA Extraction kit(TaKaRa，Code No. 9769)試劑盒提取總RNA。用NanoDrop檢測總RNA的濃度和純度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。然后對樣品的總RNA進(jìn)行純化，供后續(xù)構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.2 cDNA第一鏈和第二鏈的合成

取1.0 μg RNA，用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech，Code No.634901)試劑盒合成第一鏈cDNA。用LD-PCR(long distance PCR)法根據(jù)Advantage 2 PCR Kit試劑盒說明書來擴(kuò)增合成第二鏈cDNA。

1.2.3 cDNA文庫均一化處理及擴(kuò)增

使用TRIMMER DIRECT cDNA Normalization Kit(Evrogen，Cat # NK003)試劑盒對純化后的cDNA進(jìn)行均一化處理，由于在加入已知配體修飾的ds-cDNA變性后，復(fù)性過程中拷貝數(shù)高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變?yōu)閐s-cDNA的速率遠(yuǎn)高于低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，利用雙鏈特異核酸酶(DSN)降解ds-cDNA片段可達(dá)到均一化的目的[12]。對均一化處理后的ss-DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體操作見Advantage 2 PCR Kit(Clontech，Code No.639206 )試劑盒說明書。

1.2.4 ds-cDNA純化及短片段去除

使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa，Code No.9761)對擴(kuò)增得到的cDNA進(jìn)行純化處理，并用無菌水溶解。使用限制性內(nèi)切酶SfiI對cDNA進(jìn)行酶切，并使用CHROMASPIN-1000-TE對酶切后的cDNA過柱處理，去除短片段，經(jīng)PCI/CI凈化和乙醇精制后，用ddH2O溶解。取1 μL cDNA用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 cDNA初級文庫的構(gòu)建及庫容檢測

使用DNA ligation Kit(TaKaRa，Code No.6022)試劑盒將pGADT7-SfiI三框載體與5～10 μL過柱后的cDNA于12 ℃過夜連接，純化后得到初級cDNA文庫。取三種少量初級文庫連接產(chǎn)物，分別電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞HST08，取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分不同濃度梯度涂布于Amp+抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，通過觀察平板上生長的菌落個數(shù)，計算初級文庫庫容。

1.2.6 cDNA文庫插入片段的電泳分析及次級文庫構(gòu)建

分別取三種讀碼框文庫滴定后的平板，分別隨機(jī)挑取16個單菌落，使用pGADT7載體的通用引物(pGADT7-F：5′- GGAGTACCCATACGACGTACC -3′，pGADT7-R：5′- TATCTACGATTCATCTGCAGC -3′)對文庫插入片段進(jìn)行分析，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行片段大小檢測。隨機(jī)選取96個單克隆測序來驗(yàn)證均一化的效果。然后根據(jù)庫容檢測數(shù)據(jù)，取三種讀碼框文庫共1×106克隆，根據(jù)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞說明書，計算需要的連接產(chǎn)物體積，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞HST08中，涂布10個LB平板， 37 ℃過夜培養(yǎng)，并挑單菌落進(jìn)行搖培，使用NucleoBond Xtra Midi EF(MNG，Code No.U0420B)試劑盒提取質(zhì)粒，取100 ng質(zhì)粒用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 HSP40誘餌載體的構(gòu)建及自激活檢測

使用BamHI限制性內(nèi)切酶單酶切誘餌載體pGBKT7使其線性化，用諾唯贊同源重組試劑盒將熱激蛋白HSP40-70基因和線性化載體連接。采用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化重組誘餌載體pGBKT7-HSP40至Y2HGold酵母感受態(tài)中，涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，29 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取單克隆并稀釋10、100、1 000倍后分別點(diǎn)于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade固體培養(yǎng)基上，29 ℃培養(yǎng)3～5 d。如果SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基中菌落顏色未變藍(lán)，且SD/-Trp/AbA和SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基無菌落生長，可判斷該熱激蛋白不能自激活，可作為誘餌篩選酵母文庫。

1.2.8 以HSP40-70為誘餌篩選酵母文庫及互作蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

挑取SD/-Trp固體培養(yǎng)基上含pGBKT7-HSP40-70的酵母菌落至100 mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基，29 ℃搖培至OD600=0.8左右，室溫離心棄上清，收菌至4 mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基中懸浮。與1 mL雙雜交文庫菌液混合轉(zhuǎn)入含45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中，緩慢震蕩培養(yǎng)。融合20 h后，用光學(xué)顯微鏡觀察酵母有無結(jié)合體出現(xiàn)。若出現(xiàn)，用50 mL 0.5×YPDA沖洗錐形瓶2次，離心棄上清，收集菌體至5 mL 0.5×YPDA，涂板于SD/-His /-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，29 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取長出的單菌落劃線至SD/-Trp /-Leu/ -His/-Ade固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行二次篩選，生長良好并顯藍(lán)的單菌落即為候選互作蛋白[13]。將候選互作蛋白轉(zhuǎn)至QDO液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁菌體，使用天根酵母提取質(zhì)粒盒提取酵母質(zhì)粒。將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，使用pGADT7載體的通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測，挑取陽性克隆送往楊凌奧科生物公司測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對，若讀碼框正常，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將質(zhì)粒分別與pGBKT7-HSP40-70載體回轉(zhuǎn)至酵母菌Y2HGold中，并涂布于SD /-His/-Ade培養(yǎng)基上。挑取單菌落，稀釋10、100、1 000倍后點(diǎn)在QDO/X/A培養(yǎng)基上，若酵母菌正常生長并顯藍(lán)色，則為真實(shí)互作蛋白。陽性對照為共轉(zhuǎn)pGBKT7-53和pGADT7-T兩種質(zhì)粒的酵母菌，陰性對照為共轉(zhuǎn)pGBKT7-Lam和pGADT7-T兩種質(zhì)粒的酵母菌[14]。

1.2.9 序列分析

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST數(shù)據(jù)庫分析與HSP40-70誘餌蛋白的互作蛋白[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 N9134的苗期抗白粉病抗性表現(xiàn)

室內(nèi)條件下，與小麥苗期接種BgtE09，結(jié)果(圖1)表明，對照陜優(yōu)225的反應(yīng)型為4級，表現(xiàn)為高感；N9134的反應(yīng)型為0級，表現(xiàn)為免疫。

A：陜優(yōu)225(對照)；B：N9134。

2.2 總RNA的提取

提取N9134的總RNA，經(jīng)分光光度計檢測，其OD260/280比值為2.01，OD260/230比值為2.20，表明RNA純度較高。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能觀察到總RNA中28S和18S兩條帶，表明RNA完整(圖2)，可用于下一步文庫構(gòu)建。

圖2 N9134葉片總RNA的電泳檢測結(jié)果Fig.2 Electrophoresis analysis of total RNA extracted from the leaves of N9134

2.3 ds-cDNA合成與鑒定結(jié)果

對合成的cDNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖3A)發(fā)現(xiàn)，ds-cDNA片段主要分布在300～3 000 bp之間，且在大約1 500 bp處條帶最亮，表明不同大小片段的mRNA均進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，且在1 500 bp處的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量較高。

2.4 ds-cDNA的均一化處理結(jié)果

從圖3B可以看出，經(jīng)過均一化處理的ds-cDNA已經(jīng)沒有較亮的特異條帶，在2 500 bp以下呈現(xiàn)出亮度均勻的彌散條帶，表明不同片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拷貝數(shù)已被調(diào)節(jié)至相似數(shù)量。

2.5 ds-cDNA SfiI酶切處理及短片段去除結(jié)果

從圖3C可以看出，SfiI酶切處理及短片段去除處理后，基本去除了500 bp以下的短片段，保留的長片段增加了包含完整ORF的可能，保證了插入片段信息的質(zhì)量，使得文庫構(gòu)建更加 高效。

2.6 初級cDNA文庫構(gòu)建及庫容檢測結(jié)果

將pGADT7-SfiI三框載體與處理后的 cDNA過夜連接后，得到初級cDNA文庫，然后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并涂板，通過觀察不同稀釋濃度梯度平板上的菌落個數(shù)，計算出初級文庫庫容為：讀碼框1文庫約大于1.0×106cfu·mL-1，讀碼框2文庫約大于1.1×106cfu·mL-1，讀碼框3文庫約大于1.2×106cfu·mL-1，庫容量滿足篩庫要求。

2.7 初級cDNA文庫插入外源片段檢測及次級文庫構(gòu)建結(jié)果

通過pGADT7載體檢測引物擴(kuò)增隨機(jī)選取的三種讀碼框菌落，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，插入片段的大小分布范圍為400～2 000 bp，平均大于1 000 bp；重組率約為100%。對初級文庫的96個單克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)有3個冗余序列，冗余率約3%。根據(jù)庫容檢測數(shù)據(jù)，取1×106個克隆的連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化后涂板，并回收菌落提取質(zhì)粒，取100 ng擴(kuò)增文庫質(zhì)粒進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)條帶大小一致，說明提取質(zhì)粒質(zhì)量較好，核酸濃度檢測儀顯示其濃度大小為1 μg·μL-1，證明文庫擴(kuò)增質(zhì)量較好。

2.8 HSP40-70誘餌載體及自激活檢測結(jié)果

將構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-HSP40-70轉(zhuǎn)化到酵母菌菌株Y2HGold中，將轉(zhuǎn)化后的單菌落稀釋10、100、1 000倍后點(diǎn)于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在SD/-Trp培養(yǎng)基上酵母菌生長良好，加入X-α-Gal后無顯色反應(yīng)，且在SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培養(yǎng)基上均無酵母菌生長(圖5)，說明熱激蛋白HSP40-70誘餌載體不能自激活報告基因，可以進(jìn)一步通過酵母雙雜交方法篩選構(gòu)建成功的cDNA文庫。

2.9 誘餌載體篩選文庫及互作蛋白梯度稀釋驗(yàn)證結(jié)果

將轉(zhuǎn)有pGBKT7-HSP40-70的Y2HGold菌株與小麥雙雜交酵母文庫雜交，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)合體時，將其涂布在DDO/X/AbA培養(yǎng)基上，得到5個生長正常且顯藍(lán)色的單菌落。將這5個單菌落溶于ddH2O中，并在QDO平板上劃線培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)初篩編號為3的酵母菌沒有生長，其余4個編號的酵母菌均長勢良好(圖6)，說明這4個編號的酵母菌含有熱激蛋白HSP40-70的候選互作蛋白。在QDO液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁長勢良好的候選酵母菌，并提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并進(jìn)行菌落PCR檢測后，將陽性菌落搖培后送公司測序。利用NCBI分析互作蛋白的測序結(jié)果后，本研究選取編號為2和4的2個候選酵母菌進(jìn)行濃度梯度稀釋驗(yàn)證。將pGADT7 重組載體分別與pGBKT7-HSP40-70載體共同轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold菌株中，將其涂布在SD /-His/-Ade培養(yǎng)基上。挑取長出的單菌落稀釋10、100、1 000倍后點(diǎn)至QDO/X/A培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)酵母菌正常生長并顯藍(lán)色(圖7)，說明這2個候選蛋白與誘餌蛋白>HSP40-70存在互作關(guān)系，該小麥酵母文庫后續(xù)可應(yīng)用于蛋白互作篩選。

M：250 bp DNA Ladder Marker；1：ds-cDNA；2：均一化ds-cDNA；3：SfiI酶解的ds-cDNA。

M：250 bp DNA ladder marker；1～48：插入外源片段電泳檢測。

圖5 HSP40-70誘餌載體的自激活檢測Fig.5 Self-activation detection of HSP40-70 decoy carrier

圖6 HSP40-70互作蛋白的篩選Fig.6 Screening for interacted protein of HSP40-70

圖7 HSP40-70與候選蛋白的互作驗(yàn)證Fig.7 Interaction verification between HSP40-70 and candidate proteins

2.10 互作蛋白的功能注釋

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST對2個候選蛋白的ORF序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，編號為2的蛋白為DnaJ類蛋白，編號為4的蛋白編碼E3泛素蛋白連接酶AIP2。

3 討 論

制備高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫是進(jìn)行大規(guī)模篩選候選互作蛋白的基礎(chǔ)[16]。cDNA文庫的構(gòu)建具有器官、組織或細(xì)胞特異性，由于白粉病的發(fā)病部位為葉片，因此，本試驗(yàn)材料選用白粉病侵染后的葉片，確保了葉片部位特異表達(dá)基因的最大化收集。高質(zhì)量的RNA是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫的前提，本研究中所提取的RNA電泳檢測顯示有清晰的28S及18S兩條帶，說明所提的RNA質(zhì)量高。cDNA文庫質(zhì)量評價有兩個重要的指標(biāo)，即文庫的庫容和重組序列的完整性。本研究中三框文庫的庫容均大于有效文庫的濃度要求1.0×106cfu·mL-1，且構(gòu)建的文庫重組率為100%，插入片段分布在400～2 000 bp，大小不同且大片段居多，說明本研究構(gòu)建的文庫完全滿足高質(zhì)量文庫的要求。本研究使用熱激蛋白HSP40-70誘餌蛋白對該小麥酵母文庫進(jìn)行篩選，最終篩選到DnaJ類似蛋白和E3泛素蛋白連接酶AIP2與其互作。DnaJ蛋白屬于熱激蛋白的分子伴侶，參與大部分細(xì)胞過程[17]。泛素蛋白酶體途徑是所有真核生物體生長發(fā)育以及應(yīng)對脅迫的重要途徑，泛素連接酶E3特異性識別靶蛋白，在該途徑中具有重要的作用[18-19]。本研究中HSP40-70和E3泛素蛋白連接酶AIP2互作，說明HSP40-70參與植物脅迫應(yīng)答過程。綜上所述，本研究構(gòu)建的小麥酵母文庫可應(yīng)用于后續(xù)的蛋白互作篩選。

本研究采用的SMART酵母文庫構(gòu)建體系使得試驗(yàn)步驟更加簡潔。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，同時依賴DSN酶降解ds-cDNA和DNA-RNA雜交鏈的特性來均一化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使較短的基因片段也能保留下來。本研究構(gòu)建的三框cDNA文庫是在單一cDNA文庫的基礎(chǔ)上，增加堿基使其讀碼框后移一位或兩位，從而使cDNA出現(xiàn)三種讀碼方式，保證捕捉到生物體內(nèi)真實(shí)的讀碼方式[20]。在白粉菌侵染小麥的過程中，會觸發(fā)一系列免疫以及抗病反應(yīng)，我們既可利用已知的候選蛋白和cDNA文庫去篩選相關(guān)的互作蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，也可以利用白粉菌某些毒性蛋白來快速獲取小麥體內(nèi)的病原菌應(yīng)答蛋白，從而為探明病菌侵染與植物防御的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

表1 互作蛋白的NCBI BLAST結(jié)果Table 1 NCBI BLAST results of the interacting proteins