利用CLARITY技術(shù)實現(xiàn)珊瑚組織透明化的初步探索

賴慶娜，林雪琳，王 路

(閩江學院海洋研究院，福建 福州 350108)

組織透明技術(shù)(tissue optical clearing technique)是應用水溶性有機溶劑或親水性試劑，通過浸泡、電泳、灌注等方式處理部分或者完整組織，利用高折射率介質(zhì)匹配組織折射率，降低光散射，使組織達到光學透明的技術(shù)[1]。一般常用的組織透明技術(shù)包括CLARITY(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging tissue-hydrogel)/PACT、BABB、3DISCO、iDISCO、SeeDB、CUBIC、PARS等(表1)[2-3]。其中CLARITY技術(shù)于2013年被評為十大科學突破之一，引起了學術(shù)界對組織透明技術(shù)的廣泛關(guān)注[4]。CLARITY技術(shù)是基于洗滌劑的脫脂作用，利用水凝膠包埋為組織提供物理框架支持，與蛋白質(zhì)、核酸等生物分子形成共價連接，達到使細胞結(jié)構(gòu)和分子信息得到有效保存的目的[5]。常規(guī)的CLARITY技術(shù)主要包括：1)制備以丙烯酰胺為主要成分的水凝膠；2)制備組織脂質(zhì)清除液；3)通過器官組織脈管系統(tǒng)灌注水凝膠；4)組織標本水凝膠固定，避免氣泡的形成；5)電泳主動清除或被動浸泡清除組織脂質(zhì)，實現(xiàn)組織標本的透明化[6]。其設計思路清晰，實驗步驟簡便，應用樣品多樣，從小鼠神經(jīng)組織到整體器官、斑馬魚[7]、死后人腦組織[8]等均有涉及。近年來，CLARITY技術(shù)被廣泛應用到組織的深部成像。由于組織的深部微觀結(jié)構(gòu)對于一般的激光共聚焦顯微鏡來說是一個較難達到的深度，傳統(tǒng)上要通過連續(xù)組織切片，并進行三維重構(gòu)才能達到觀察的目的。但是CLARITY技術(shù)卻可以在“無損傷”的前提下實現(xiàn)深部微觀觀察，甚至已經(jīng)有科學家利用CLARITY技術(shù)將整個小鼠做了透明化處理，包括腦，肝，腎，小腸等，得到了清晰的組織成像[9]。因此，CLARITY技術(shù)使大尺度的深度成像及自然狀態(tài)下直接分析活體結(jié)構(gòu)成為可能[10]。

珊瑚作為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于其多樣性和脆弱性而在全球環(huán)境變化的大背景下受到人們越來越多的關(guān)注。珊瑚屬于腔腸動物門珊瑚蟲綱，是腔腸動物門中最大的一個綱，有7 000余種，分為八放珊瑚亞綱及六放珊瑚亞綱[11]。目前珊瑚生態(tài)學研究的重點多集中在“共生”和“鈣化”，對珊瑚顯微結(jié)構(gòu)的觀察尤為重要，但是由于珊瑚外形多樣、顏色鮮艷，大大加深了研究其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的難度。傳統(tǒng)方法通常采用解剖或者切片技術(shù)研究珊瑚的內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)，但是這些方法常會破壞研究對象的完整性或細胞顯微結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，不利于對整體形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究。而透明化技術(shù)可以在保持組織完整性的基礎上達到顯微成像效果，從而為珊瑚共生和鈣化過程的理解提供新的研究思路。目前，組織透明技術(shù)在珊瑚研究領域逐步得到應用，主要是通過組織脫水對珊瑚進行透明成像并獲得了珊瑚全生物體三維成像圖[12]，然而CLARITY技術(shù)在珊瑚研究領域中的嘗試與應用目前尚未檢索到相關(guān)報道。

本研究以軟珊瑚中親緣關(guān)系較近的兩個種Xeniaumbellata和Xeniaelongata為實驗對象，通過梯度調(diào)整CLARITY實驗步驟中主要試劑的濃度，成功摸索出透明化珊瑚的最佳試劑濃度。透明化后的珊瑚組織可被清晰觀察到珊瑚蟲完整的水螅體及消化腔的組織結(jié)構(gòu)，成功彌補了傳統(tǒng)組織學研究方法中的一些不足，避免了切片間的信息丟失，為珊瑚在神經(jīng)發(fā)育、胚胎發(fā)育、骨骼發(fā)育、共生關(guān)系等方面的研究提供了有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 珊瑚培養(yǎng)與鑒定

1.1.1 水族箱培養(yǎng)

將Xeniaumbellata和Xeniaelongata培養(yǎng)于循環(huán)海水水族箱中，設置水族箱中海水溫度為(25±2)℃，鹽度32%～35%，pH=8.1。珊瑚養(yǎng)殖使用hqi-10000K金屬鹵化物燈(BLV-Nepturion)提供有效光輻射強度(PAR)180 μmol-2·s-1，光暗周期為12 h∶12 h。

1.1.2 DNA提取、PCR與測序

取3～5個完整的珊瑚水螅體，使用液氮速凍后在研砵中將組織研磨均勻，研磨后的粉末加入DNA裂解液(10 mmol·L-1Tris pH 8.0；100 mmol·L-1EDTA pH8.0；0.5%SDS；100 μg·ml-1蛋白酶K)，56 ℃下孵育48 h。用CTAB法提取DNA，并用DNA純化富集柱(Zymo Research；Orange；CA；USA)進行核酸純化。最后將純化后的DNA溶解在10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific；Inc.；Wilmington；DE；USA)檢測核酸濃度，置于-20 ℃儲藏。

采用珊瑚特異型引物對大核糖體亞基(28S rRNA)進行擴增，正向引物為28S-Far(5’-CACGAGACCGATAGCGAACAAGTA-3’)，反向引物為28S-Rar(5’-TCATTTCGACCCTAAGACCTC-3’)[13]。PCR擴增體系包括15μl帶GE緩沖液的PCR Phusion Master Mix，2 μmol·L-1正向和反向引物，以及10ng DNA模板。反應流程為：94 ℃預變性1 min；34個循環(huán)(95 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min)；72 ℃延伸7 min。PCR結(jié)束后，進行2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，檢測產(chǎn)物長度。之后采用凝膠回收試劑盒進行產(chǎn)物純化，并進行后續(xù)的測序。

1.1.3 分子鑒定與進化分析

將測序結(jié)果在NCBI中進行序列比對，得到與已知rDNA相似性較高的基因序列后下載。28S rDNA基因序列的選擇基于Catherine[14]報道的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用CLUSTAL X進行序列比對并調(diào)整校準參數(shù)[15]進行手動編輯。使用GTR模型在PhyM服務器上進行了最大似然法系統(tǒng)發(fā)育分析(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/)。

1.2 方法

1.2.1 組織固定

取珊瑚組織樣品，25 ℃下在7%氯化鎂中孵育10 min[16]，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中4 ℃過夜，PBS溶液清洗3遍后，放入配置好的水凝膠緩沖液中，4 ℃低溫孵育3 d。水凝膠緩沖液配比如下：4%多聚甲醛，濃度梯度分別為1%和4%的丙烯酰胺，0.05%雙丙烯酰胺(丙烯酰胺：雙丙烯酰胺比例為20∶1)，0.25%VA-044(溫度依賴型引發(fā)劑)溶于1xPBS中。

1.2.2 水凝膠形成

在水凝膠緩沖液上滴入礦物油以隔絕空氣，然后將樣品37 ℃水浴孵化3 h。

1.2.3 脂質(zhì)的清除

溫育后將組織浸沒于含有SDS的硼酸緩沖液(0.2 mmol·L-1，pH 8.5)中，其中SDS濃度梯度分別為4%和8%，37℃恒溫搖床孵育5 d，每天更換緩沖液。TPBS(1xPBS；0.1%Triton X-100)37 ℃恒溫搖床孵育2 d，每天更換緩沖液[6]。

1.2.4 樣品的保存

RIMS緩沖液保存樣品，RIMS緩沖液配方[8]：20 mmol·L-1PBS緩沖液(pH7.5)15 mL ，碘海醇20 g，10%疊氮鈉緩沖液250 μL。

1.2.5 組織觀察與拍照

應用萊卡體視顯微鏡(Leica M165FC)觀察并拍攝透明化前后的珊瑚水螅體。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種珊瑚的系統(tǒng)分類

以Catherine[14]報道的28S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹為框架，獲知本研究涉及的兩種珊瑚分別屬于不同的進化分枝(圖1)。Xeniaelongata屬于Clade X3進化分枝，Xeniaumbellata屬于Clade X1進化分枝。

圖1 Xeniidae-28srDNA家族的進化樹Fig.1 The evolutionary tree of Xeniidae-28srDNA family

2.2 不同濃度的丙烯酰胺和SDS處理后珊瑚的透明化程度

組織透明化過程中，丙烯酰胺作為水凝膠主要成分，用以替代細胞骨架架構(gòu)，保持樣品的結(jié)構(gòu)形狀；SDS作為脂質(zhì)清除液主要成分，用以去除細胞上影響大分子物質(zhì)滲透和光線透過的脂質(zhì)成分[17]。根據(jù)實驗處理所需的兩個關(guān)鍵溶液的不同溶度，設置了4個實驗組，分別為1%丙烯酰胺與4%SDS、1%丙烯酰胺與8%SDS、4%丙烯酰胺與4%SDS、4%丙烯酰胺與8%SDS，再結(jié)合一組空白對照，摸索出透明化珊瑚的最佳試劑濃度。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理組的珊瑚組織均出現(xiàn)了明顯的透明化現(xiàn)象，其中Xeniaelongata的透明化效果比Xeniaumbellata的更為明顯。透明化處理后，可以清晰地看到Xeniaumbellata單個透明化的觸手以及排列清晰的刺細胞。對比空白組，可以發(fā)現(xiàn)CLARITY技術(shù)在透明化過程中可以較好地保持組織原有的形狀，與空白對照相比，觸手更加明顯清晰，可以更清晰地觀察到觸手紋路甚至是表面的刺細胞結(jié)構(gòu)。這兩種珊瑚的透明化結(jié)果都表明，4%丙烯酰胺和4%SDS處理后的珊瑚外形保持和透明化程度最佳(圖2)。

圖2 不同比例透明液組織透明化效果Fig.2 Transparency effect of different proportions of transparent fluid

2.3 CLARITY處理后珊瑚的組織結(jié)構(gòu)觀察

水體中正常培養(yǎng)的Xeniaumbellata和Xeniaelongata在顏色形態(tài)上差距較大，Xeniaumbellata珊瑚體呈紫紅色，形態(tài)上呈平鋪的表覆形，近似于肥厚肉質(zhì)珊瑚，觸手較不明顯。Xeniaelongata呈明黃色，水螅體呈樹枝狀分枝，觸手明顯。透明化后，雖然外形上二者仍存在較大的差異，但是可以發(fā)現(xiàn)其觸手具有形似的刺細胞排列紋路，通常情況下這種微觀結(jié)構(gòu)需要通過組織切片后才能在共聚焦顯微鏡上觀察到，但是組織切片會破壞組織完整性，即使進行三維圖像重構(gòu)，也可能造成空間信息丟失。

3 結(jié)論

CLARITY技術(shù)的核心是通過組織脫脂提高組織滲透性和透明效率，尤其是對脂質(zhì)等高折射率介質(zhì)的去除，所以第一步和第二步中水凝膠和脂質(zhì)清除液的配制尤為關(guān)鍵。本次珊瑚組織透明化實驗主要以被動浸泡的形式通過設置不同濃度的丙烯酰胺和脂質(zhì)清除液SDS摸索最佳的組織透明化效果。成功透明化珊瑚Xeniaumbellata和Xeniaelongata后，可以較清晰地觀察到珊瑚水螅體及消化腔的結(jié)構(gòu)。同時，透明化后的兩種珊瑚褪去了原有的顏色，可以更容易被觀察到形態(tài)上接近的觸手結(jié)構(gòu)。CLARITY透明化技術(shù)能夠彌補傳統(tǒng)組織切片和圖像重構(gòu)的缺陷，在避免結(jié)構(gòu)信息丟失的同時成功達到微觀結(jié)構(gòu)觀察的目的，這或許可以為珊瑚甚至腔腸動物在三維重構(gòu)、神經(jīng)發(fā)育、骨骼生長、組織進化、共生關(guān)系等方面的研究提供一定的技術(shù)支持及研究思路。