代謝調(diào)控蛋白A調(diào)控革蘭陽性菌代謝與毒力偶聯(lián)的研究進展

楊紫瑜，秦娟秀，李 敏，劉 倩

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科，上海200127

代謝調(diào)控蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）是革蘭陽性菌重要的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，屬于LacI/GalR 家族，可直接或間接調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，控制細胞的生理過程。CcpA 可以通過識別并結(jié)合至靶基因的特定序列執(zhí)行其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這類結(jié)合序列被稱為代謝反應(yīng)元件（catabolite response element，cre）。1991 年在枯草芽孢桿菌中首次證實，ccpA 基因失活可解除碳分解代謝物阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR），與細菌次序利用碳源有關(guān)［1］。之后研究發(fā)現(xiàn)CcpA 存在于多種革蘭陽性菌中，包括丙酮丁醇梭菌、艱難梭菌、屎腸球菌、乳酸乳球菌、變異鏈球菌等，這些革蘭陽性菌均編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS），而CcpA 依賴PTS 調(diào)控細菌的代謝和毒力。

1 CcpA介導CCR效應(yīng)及作用機制

1.1 CCR效應(yīng)機制

CCR 是細菌中廣泛存在的機制，通過控制細菌攝取與利用外界環(huán)境中的碳源，使細菌根據(jù)自身代謝能力選擇利用能源，從而平衡其分解與合成代謝的能力。革蘭陽性菌的CCR 主要依賴CcpA 調(diào)控，CcpA 則在PTS 的輔助下調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達［2-4］。PTS 能將糖類從細胞外跨膜主動運輸進入細胞，并在此過程中將其磷酸化，被其轉(zhuǎn)運的葡萄糖、甘露糖、果糖等可以直接參與代謝反應(yīng)。細菌通過CCR 效應(yīng)優(yōu)先選擇上述糖類作為首要能量來源，維持自身的代謝平衡。在革蘭陽性菌中，PTS攝入的碳源經(jīng)過糖酵解途徑形成的中間產(chǎn)物1，6-二磷酸果糖，可促進含組氨酸的磷酸載體蛋白（histidinecontaining phosphocarrier protein，Hpr）第46 位絲氨酸殘基被Hpr 激酶（Hpr kinase，HprK）磷酸化，生成Hpr-Ser～P，其可以結(jié)合并活化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CcpA；該復合物與位于靶基因啟動子或編碼區(qū)的cre 位點結(jié)合后，可抑制編碼次要碳源轉(zhuǎn)運和代謝所需酶的基因轉(zhuǎn)錄［5-6］（圖1）。

圖1 革蘭陽性菌CcpA攝取葡萄糖過程Fig 1 Glucose uptake by CcpA in Gram-positive bacteria

枯草芽孢桿菌中存在另一種Hpr 同源蛋白Crh（catabolite repression HPr），其第46 位絲氨酸殘基也可被HprK 磷酸化，形成CcpA-（Crh-Ser～P）復合物。但Crh參與完成的PTS調(diào)控作用并不能完全替代Hpr［7］，目前已知檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運體基因（citrate transporter，citM）僅依賴Crh-Ser～P 進行PTS 調(diào)節(jié)。Hpr 與Crh 的區(qū)別在于，Hpr-Ser～P 與CcpA 的親和力高，結(jié)合能力更強［8］。除此之外，1，6-二磷酸果糖和6-磷酸果糖等小分子可以作為Hpr-Ser～P 的輔因子，根據(jù)細胞對代謝的需求刺激CcpA與DNA結(jié)合，但這類小分子不能輔助Crh-Ser～P作用［9］。

1.2 CcpA作用機制

CcpA 通過識別并結(jié)合靶基因DNA 序列中不同位置特異性cre 序列發(fā)揮功能。當cre 序列位于基因啟動子上游時，CcpA 通常具有激活效應(yīng)；如在枯草芽胞桿菌中，CcpA 可以促進乙酸激酶編碼基因（acetate kinase，ackA）、 磷 酸 轉(zhuǎn) 乙 酰 酶 編 碼 基 因 （phosphate acetyltransferase，pta）的轉(zhuǎn)錄表達［10］。當cre序列位于靶基因的啟動子區(qū)或編碼區(qū)時，CcpA 通常產(chǎn)生阻遏效應(yīng)；如在艱難梭菌中，CcpA 抑制RNA 多聚酶σ 因子（σ factor required for toxin production，tcdR）、乳酸脫氫酶等基因的轉(zhuǎn)錄表達［11］。然而，cre 序列的位置與CcpA的效應(yīng)并不是絕對的；比如枯草芽孢桿菌中CcpA 結(jié)合果糖操縱子（levD、levE、levF、levG）的啟動子上游區(qū)cre序列，卻抑制了該操縱子的轉(zhuǎn)錄［12］。

1.3 CcpA調(diào)節(jié)機制

CcpA 可以調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄表達，戊糖乳桿菌和木糖葡萄球菌中，CcpA 可以結(jié)合自身啟動子區(qū)單個cre 位點，調(diào)節(jié)ccpA 表達［13-14］。在丙酮丁醇梭菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的雙向自我調(diào)控機制，ccpA 基因上存在2 個CcpA 結(jié)合位點：分別位于其啟動子區(qū)（CcpA-creP） 和編碼區(qū)（CcpA-creORF），CcpA 與CcpA-creP結(jié)合能通過募集RNA多聚酶促進ccpA 的表達，而與CcpA-creORF結(jié)合則通過阻遏基因轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達［15］。此外，CcpA本身受細菌生長環(huán)境的影響，在肺炎鏈球菌中，高濃度的甲酸鹽能促進谷氨酰胺合成酶轉(zhuǎn)錄抑制子GlnR 與ccpA基因上游的cre 序列結(jié)合，從而上調(diào)ccpA 表達［16］。CcpA 同時也受細菌編碼的其他調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控。金黃色葡萄球菌中參與中心代謝的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 （serine/threonine protein kinase 1，Stk1），可以將CcpA的第18位和第33位蘇氨酸磷酸化，使其DNA 結(jié)合能力減弱，且CcpA 磷酸化菌株與ccpA 基因敲除株的靶基因表達水平和生物被膜形成能力相似。這進一步證明了Stk1對CcpA 的磷酸化抑制了CcpA 對靶基因的調(diào)控［17］，代表了一種新的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)機制。但Stk1對CcpA 的磷酸化調(diào)控作用尚未在其他菌屬中報道，提示在不同菌屬中CcpA 活性的調(diào)節(jié)具有差異。

2 CcpA在細菌代謝調(diào)控中的作用

2.1 CcpA調(diào)控糖代謝

糖類是細菌的主要能源物質(zhì)。微生物在以糖類為主要能源時，CcpA 可以調(diào)控代謝相關(guān)基因的表達，合理利用碳源［16，18-27］。

枯草芽孢桿菌中，CcpA 促進PTS 轉(zhuǎn)運糖類過程中產(chǎn)生大量3-磷酸甘油醛，抑制中心糖酵解基因調(diào)節(jié)子結(jié)合3-磷酸甘油醛脫氫酶操縱子，間接促進3-磷酸甘油醛脫氫酶的表達，激活糖酵解途徑［19-20］。在德氏乳桿菌保加利亞亞種和乳酸乳球菌中，CcpA 能上調(diào)las 操縱子（編碼乳酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）的表達［21-23］，不僅促進糖酵解，還使丙酮酸代謝為L-乳酸，減少進入三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）的碳流量。變異鏈球菌中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶可以促使丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸，使其自身適應(yīng)外界壓力環(huán)境。CcpA 在1，6-二磷酸果糖的作用下結(jié)合ackA啟動子區(qū)域的cre序列，通過高表達乙酸激酶促進丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?；乙酸等代謝物的堆積導致環(huán)境pH 值降低，CcpA 又通過抑制pta 表達，減少乙酸的堆積［24］。同樣，在枯草芽孢桿菌中，CcpA和轉(zhuǎn)錄因子CodY（transcriptional regulator，GTP and BCAAdependent）協(xié)同作用，通過結(jié)合ackA 基因編碼序列的上游區(qū)域，上調(diào)ackA 表達，促進丙酮酸代謝為乙酸，使細菌合理利用碳源［25］。金黃色葡萄球菌中，CcpA通過直接結(jié)合編碼TCA循環(huán)的重要酶基因的cre序列，阻遏烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶和檸檬酸合酶等轉(zhuǎn)錄表達，從而抑制TCA循環(huán)［26-27］。

細菌以葡萄糖為首選碳源，但當缺乏葡萄糖時，CcpA 可調(diào)節(jié)其他糖代謝途徑以維持細菌生存。在半乳糖豐富的環(huán)境中，細菌利用半乳糖產(chǎn)生多種有機酸，其中丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate formate lyase，PFL）是一種關(guān)鍵酶。PFL 需要丙酮酸甲酸裂解酶活化酶（pyruvate formate-lyase activating enzyme，Pfla）和丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate formate-lyase，Pflb）共同作用而催化半乳糖代謝，CcpA 通過影響PFL 的活性來調(diào)節(jié)半乳糖代謝途徑［16］。在富含半乳糖且氧氣缺乏的環(huán)境中，肺炎鏈球菌CcpA 通過上調(diào)pflB 的表達，促進細菌發(fā)酵半乳糖來獲取能量［16］。乳酸乳球菌的半乳糖操縱子，如阿拉伯半乳聚糖 內(nèi)- β -1，4- 半 乳 聚 糖 酶 編 碼 基 因 （putative arabinogalactan endo-β-1，4-galactanase，galA）、半乳糖變旋酶編碼基因（galactose-1-epimerase，galM）、半乳糖激酶編碼基因（galactokinase，galK）、半乳糖-1-磷酸尿苷 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 編 碼 基 因 （galactose-1-phosphate uridylyltransferase，galT）、UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶編碼基因（UDP-glucose 4-epimerase，galE），能夠編碼攝取和轉(zhuǎn)化半乳糖的關(guān)鍵酶；且galA 啟動子區(qū)存在cre 序列，當半乳糖為唯一碳源時，細菌CcpA 通過調(diào)控半乳糖操縱子的表達促使細菌利用半乳糖，促進自身生長［23］。

2.2 CcpA調(diào)控蛋白質(zhì)代謝

CcpA 可以調(diào)控細菌攝取及利用氨基酸的能力。艱難梭菌中CcpA 可促進脯氨酸還原酶表達，催化脯氨酸轉(zhuǎn)化為5-氨基戊酸，促進艱難梭菌在腸道中定植［28］。金黃色葡萄球菌利用谷氨酸鹽合成精氨酸，而ccpA 突變金黃色葡萄球菌株還可以利用脯氨酸作為底物，通過尿素循環(huán)合成精氨酸，提示CcpA 可能通過抑制脯氨酸代謝來調(diào)控精氨酸合成［29］。在高濃度葡萄糖環(huán)境中，金黃色葡萄球菌CcpA 通過結(jié)合氨基酸降解酶（如丙氨酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和精氨酸酶）編碼區(qū)的cre序列［25］，阻遏細菌大量利用氨基酸。而當生存環(huán)境中葡萄糖受限（如細菌在宿主體內(nèi)形成膿腫），谷氨酸成為金黃色葡萄球菌的首選能量來源。因此若谷氨酸不足，細菌通過下調(diào)ccpA 表達，促進細菌利用脯氨酸、組氨酸、精氨酸來合成谷氨酸，以維持自身生長［30］。

2.3 CcpA調(diào)控脂肪酸代謝

細胞膜的脂肪酸組分變化是變異鏈球菌應(yīng)對酸性環(huán)境的機制之一。酸性環(huán)境中，變異鏈球菌CcpA 可與fabTSm（變異鏈球菌中脂肪酸代謝合成基因簇成員）編碼區(qū)上游的cre 序列結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)脂肪酸合成基因簇中fabM 的表達，導致長鏈不飽和脂肪酸與短鏈飽和脂肪酸比例上調(diào)，增強細菌抗酸能力［31］。在葡萄糖豐富的環(huán)境中，金黃色葡萄球菌CcpA 抑制甘油攝取蛋白和甘油激酶基因表達，降低外源甘油的利用率，同時抑制乙酰輔酶A 羧化酶，減少脂肪酸合成，從而在一定程度上阻遏脂肪酸代謝［25］。

3 CcpA在細菌毒力調(diào)控中的作用

3.1 CcpA影響細菌結(jié)構(gòu)

細菌的莢膜、鞭毛等結(jié)構(gòu)成分與細菌毒力密切相關(guān)，在細菌黏附入侵和感染過程中發(fā)揮重要作用。通過cDNA表達陣列對高毒力豬鏈球菌血清2 型的CcpA 功能分析發(fā)現(xiàn)，ccpA 突變菌株中共259 個基因表達水平發(fā)生變化，其中與莢膜和細胞壁合成相關(guān)的18 個基因表達下調(diào)；電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ccpA 突變菌株的莢膜厚度顯著下降；此外，ccpA 突變菌株與豬血漿蛋白的黏附能力增強，抵抗豬中性粒細胞殺傷能力減弱，證明了CcpA 促進豬鏈球菌的莢膜形成和提高毒力［32］。單核細胞增生李斯特菌的ccpA 缺失菌株無法形成鞭毛，從而減弱了細菌的擴散能力，提示CcpA 參與調(diào)控細菌鞭毛的形成過程［33］。血鏈球菌SK36 的四型菌毛（type Ⅳpili，Tpf）對于細菌的宿主細胞黏附至關(guān)重要，而缺乏CcpA 時菌毛相關(guān)基因的表達受到明顯抑制［34］。

3.2 CcpA影響毒素合成

CcpA 是細菌毒素表達的重要調(diào)節(jié)因子之一。艱難梭菌毒素的產(chǎn)生受到葡萄糖或其他碳源的抑制，但不受代謝引起的pH 值變化的影響。研究者［35］發(fā)現(xiàn)當葡萄糖存在時，ccpA 突變艱難梭菌株中糖基化毒素基因（glycosylating toxin TcdA，tcdA）和tcdB 表達水平下降，證明葡萄糖和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CcpA 是抑制毒素基因表達的關(guān)鍵因子。該研究者還發(fā)現(xiàn)，CcpA 可以與艱難梭菌毒素基因座中5個cre位點結(jié)合，其中，CcpA與tcdR的啟動子親和力最強，可以抑制tcdR 的表達，從而抑制艱難梭菌的主要毒素TcdA 和TcdB 的產(chǎn)生，證明了在艱難梭菌中CcpA 作為代謝調(diào)控蛋白能同時調(diào)節(jié)細菌的毒力因子［11，35］。在咽峽炎鏈球菌和A 群鏈球菌中，CcpA 也能通過直接與鏈球菌溶血素S的啟動子結(jié)合來抑制溶血素的產(chǎn)生［36-37］。在高糖培養(yǎng)條件下，金黃色葡萄球菌的CcpA 促進其重要毒力因子α溶血素的表達，增強細菌的毒力［38］。

CcpA 可與其他全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用影響細菌毒力，如CcpA 與CodY 可共同調(diào)控四型產(chǎn)氣莢膜梭菌中ε 毒素的產(chǎn)生；此外，CcpA 能直接與codY 起始密碼子上游結(jié)合促進codY 基因的轉(zhuǎn)錄［39］。艱難梭菌中CodY 在支鏈氨基酸和GTP的輔助下，可與CcpA共同抑制tcdR的表達和丁酸鹽形成，從而抑制毒素產(chǎn)生［40］。產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞在腸道中產(chǎn)生的毒素（C. perfringens enterotoxin，Cpe）可導致食物中毒； CcpA 在腸道中促進芽孢產(chǎn)生，進而活化孢子形成特異性聚合酶（RNA polymerase sporulation-specific sigma-29 factor，SigE）、SigK，活化的SigE、SigK 可與cpe基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進Cpe的合成［41］。

3.3 CcpA調(diào)控細菌致病性

細菌代謝變化和毒素表達與細菌的致病性密切相關(guān)。動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，CcpA 通過調(diào)控細菌代謝和毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達，提高細菌的致病性［42-44］。小鼠皮膚膿腫感染模型研究表明，化膿鏈球菌ccpA 敲除株的毒力較野生菌株顯著減弱，具有高DNA 結(jié)合力的ccpAT307Y點突變株毒力雖有下降，但細菌定植率明顯增高［42］。同樣在屎腸球菌中也發(fā)現(xiàn)，在心內(nèi)膜炎感染小鼠模型中，ccpA 基因突變株的生長速度和毒力均顯著降低［43］。

肺炎鏈球菌通過TprA/PhrA 群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)調(diào)控自身對半乳糖和甘露糖的利用能力、神經(jīng)氨酸酶活性和大量細胞外毒力因子。CcpA 通過感知外界環(huán)境的變化調(diào)控QS 系統(tǒng)，如在葡萄糖存在時抑制tprA（多效性調(diào)控子的直系同源物）啟動子，在半乳糖存在時促進tprA 表達；由于宿主體內(nèi)不同組織中所含糖的種類與濃度不同，如呼吸道可分泌半乳糖和甘露糖，而血液中葡萄糖濃度更高，CcpA 可根據(jù)不同部位糖類的不同促進或阻遏tprA 的表達，有利于細菌在不同組織中的定植與感染［44］。

4 總結(jié)

綜上所述，CcpA 通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了細菌的生存及致病過程。CcpA 調(diào)控的基因廣泛參與革蘭陽性菌糖酵解、TCA循環(huán)和氨基酸代謝等，同時CcpA也影響細菌致病性，從而將細菌的代謝和毒力偶聯(lián)。CcpA 還可調(diào)控細菌在不同培養(yǎng)環(huán)境下的生存能力，但其如何在不同環(huán)境中通過特定的功能域調(diào)控特異代謝途徑從而發(fā)揮功能尚未完全闡明。CcpA 調(diào)控細菌定植、致病及耐藥的分子機制有待于進一步研究。

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